炔烃修饰的寡核苷酸与染料叠氮化物的缀合

点击化学缓冲液适用于含有炔烃的寡核苷酸的合成后缀合。带有末端炔的寡核苷酸可以使用炔亚磷酰胺合成，或者您也可以在我们的网站上订购修饰寡核苷酸的合成。

叠氮化物与修饰寡核苷酸的末端炔缀合，形成五元杂环。这两个基团（叠氮基和炔烃）在天然生物分子中都极为罕见，因此该反应具有高度特异性，可以有效地处理各种任务。

该反应在铜 (I) 存在下、中性 pH 值下进行。催化缓冲液含有铜 (II)、醋酸三乙铵 pH 7 和 DMSO。建议使用新配制的 抗坏血酸溶液来还原铜 (II)。

对于此反应，您将需要炔烃修饰的寡核苷酸、叠氮化染料、点击化学缓冲液和抗坏血酸。您可以在我们的网站上在线订购所有试剂。

协议

我们推荐以下方案用于含炔寡核苷酸与叠氮化染料的缀合：

1. 根据要使用的寡核苷酸的量确定总反应体积：

   寡核苷酸的量	总反应体积，μL
   4至20纳摩尔	100
   20至40纳摩尔	200
   40至80纳摩尔	400
   80 至 600 纳摩尔	600

2. 使用下表计算标记反应的试剂体积：

   试剂	体积，微升	原液浓度
   叠氮化染料	(寡核苷酸量[nmol])×0.15	10 mM DMSO 溶液
   点击化学缓冲液	（总反应体积[μL]）×0.67	1.5倍
   活化剂 （抗坏血酸）	（总反应体积[μL]）×0.02	50 mM 水中
   水（用于溶解寡核苷酸）	（总反应体积 [μL] – 叠氮化染料溶液的体积 [μL] – 缓冲液的体积 [μL] – 活化剂溶液的体积 [μL]）	—

3. 准备叠氮化染料（DMSO 中 10 mM）和活化剂（抗坏血酸，水中 50 mM） 的储备溶液 。

   请记住，抗坏血酸在空气中很容易氧化。仅使用新配制的活化剂溶液（该溶液在 1 天内稳定）。要制备储备溶液，请将 10 mg抗坏血酸溶解在 1.1 mL 水中。

4. 将寡核苷酸溶解在 2 mL 塑料管中 计算体积的 水中。

5. 添加点击化学缓冲液和涡旋。

6. 添加计算体积的叠 氮化染料储备溶液并再次涡旋。

7. （受到推崇的）。将混合物脱气以除去氧气。为此，将一次性移液器吸头连接到塑料或硅胶管，该管连接到装有惰性气体（氩气、氮气或氦气）的气瓶的压力调节器。打开非常弱的气流并将头部放入管中，使其比液位高 3-10 毫米，避免接触液体和管壁。气流应在液体中形成漩涡而不溅出液体。将头部保持在该位置 10-20 秒。

   如果同时运行多个标记反应，则可以使用 SpeedVac 型系统进行脱气。为此，将管子放入系统中，打开旋转，打开真空 30-40 秒，然后关闭真空，同时向系统输入端注入惰性气体。

8. 添加活化剂溶液（抗坏血酸），然后用惰性气体吹扫管几秒钟并关闭它。

9. 涡旋溶液。如果反应过程中形成沉淀，请将管在热水 (70–95 °C) 中加热，直至沉淀溶解并涡旋溶液。

10. 让混合物在室温下静置 8-16 小时。

11. 添加 2M 高氯酸锂溶液（每 5 体积的反应混合物 1 体积），涡旋溶液，并添加额外的纯丙酮至 2 mL。

12. 摇动管子并使其在-20°C 下静置 20 分钟。

13. 以 10,000 RPM 离心 10 分钟，分离沉淀物。丢弃上清液。

14. 将 1 mL 丙酮添加到沉淀物中。摇动管数次，并以 10,000 RPM 离心 10 分钟分离沉淀物。丢弃上清液。

15. 让沉淀物在室温下在开口管中干燥 1 小时或将管放入 65°C 的加热块中 10 分钟。

16. 将沉淀物溶解于水中，并通过HPLC纯化目标产物

炔烃或叠氮化物修饰的蛋白质与染料叠氮化物或炔烃的缀合

蛋白质标记缓冲液适用于 CuAAC 与蛋白质的反应，可保护生物分子免受活性氧的损害。该反应可用于具有炔烃或叠氮基团的蛋白质，以及用叠氮基团代谢标记的细胞或细胞裂解物的组分。

叠氮化物与末端炔烃缀合，形成五元杂环（1,2,3-三唑）。这两个基团（叠氮基和炔烃）在天然生物分子中都极为罕见，因此该反应具有高度特异性，可以有效地处理各种任务。

该反应在铜 (I) 化合物存在下进行，几乎不依赖于 pH 值。蛋白质标记缓冲液针对蛋白质操作进行了优化，含有铜 (II) 盐（催化活性铜 (I) 化合物的稳定前体）、醋酸三乙铵 pH 6.8、水溶性 THPTA 配体和氨基胍。建议使用新鲜配制的 抗坏血酸溶液减少铜(II)。蛋白质标记缓冲液中的 THPTA 配体通过稳定铜 (I) 的催化活性化合物来加速反应。 THPTA 配体的存在还允许在水介质（无有机溶剂）中进行蛋白质标记，并且由于铜 (I) 氧化程度的稳定，最大限度地减少活性氧 (RAS) 的产生，并防止它们通过氧化组氨酸、蛋氨酸来损坏蛋白质和半胱氨酸。蛋白质标记缓冲液中的氨基胍可防止化学反应性醛（脱氢抗坏血酸水解产物）与精氨酸、N 末端半胱氨酸和赖氨酸的侧链结合。

对于此反应，您将需要无叠氮钠缓冲液中的炔烃或叠氮化物修饰的蛋白质、叠氮染料或 炔烃、1.5х蛋白质标记缓冲液和抗坏血酸。建议在惰性气体（氮气或氩气）下执行步骤 6 至 9。

协议

我们推荐以下方案用于修饰蛋白质与染料衍生物的缀合：

1. 根据要使用的修饰蛋白的量确定总反应体积：

   ！炔烃或叠氮化物修饰的蛋白质溶液的体积不应超过总反应体积的1/3。

   总反应体积，μL	蛋白质含量
   100	4至20纳摩尔
   200	20至40纳摩尔
   400	40至80纳摩尔
   600	80 至 600 纳摩尔

2. 使用下表计算标记反应的试剂体积：

   试剂	体积，微升	原液浓度
   染料叠氮化物或炔烃	（蛋白质含量 [nmol]）× 0.3*	10 mM DMSO 或水
   蛋白质标记缓冲液	（总反应体积[μL]）×0.67	1.5倍
   活化剂（抗坏血酸）	（总反应体积[μL]）×0.02	50 mM 水中
   水	（总反应体积 [μL] – 染料溶液体积 [μL] – 蛋白质标记缓冲液体积 [μL] – 活化剂溶液体积 [μL]）	—

   * 染料过量可能会根据蛋白质分子上叠氮化物或炔基的数量而变化。表中显示的计算结果为 3 倍过量的染料。对于 1.5–10 倍过量的染料，将蛋白质含量 (nmol) 乘以 0.15–1。但请记住，如果您使用不溶于水的叠氮化物或炔烃，则过量时它可能会从反应混合物中沉淀出来。使用水溶性染料，例如磺化花青染料sulfo-Cyanine。

3. 准备 染料叠氮化物或炔烃（10 mM 溶于 DMSO 或水中，适用于水溶性炔烃和叠氮化物）和活化剂（抗坏血酸，50 mM 水溶液）的储备溶液。

   请记住，抗坏血酸在空气中很容易氧化。仅使用新配制的活化剂溶液 （该溶液在 1 天内稳定）。要制备储备溶液，请将 10 mg 抗坏血酸溶解在 1.1 mL 水中。

4. 将蛋白质标记缓冲液添加到修饰的蛋白质溶液中并涡旋。

5. 添加计算体积的叠 氮化染料或炔烃储备溶液，并再次涡旋均匀。

6. （推荐）对混合物进行脱气以除去氧气。为此，将一次性移液器吸头连接到塑料或硅胶管，该管连接到装有惰性气体（氩气或氮气）的气瓶的压力调节器。打开非常弱的气流，放入管中，使其比液面高 3-10 毫米，避免接触液体和管壁。气流应在液体中形成漩涡而不溅出液体。将保持在该位置 10-20 秒。

   如果同时进行多个标记反应，可以使用离心浓缩器进行脱气。为此，将管子放入浓缩器中，打开旋转，打开真空 30-40 秒，然后关闭真空，同时向系统输入端输送惰性气体。

7. 添加活化剂溶液（抗坏血酸），然后用惰性气体吹扫管几秒钟并关闭它。

8. 涡旋溶液。

9. 让混合物在室温下静置 8-16 小时。

10. 使用透析或尺寸排阻色谱分离染料-蛋白质缀合物。

叠氮化物/炔基修饰的点击化学试剂用途和应用

点击化学这一概念最初源于对天然产物和生物合成途径的观察。它是由化学家KB Sharpless于2001年提出的合成概念。它是由2001年诺贝尔化学奖获得者、67岁的Sharpless教授提出的。

“点击化学”一般通过叠氮化物和炔烃相互作用形成共价键，具有高效、稳定、专一性高等优点，反应不受PH影响，可在常温条件下在水中进行，甚至在活细胞中。

分类

此外，所引入的点击化学试剂基团类型可分为以下类型：

1.叠氮化物修饰试剂（非荧光叠氮化物）的应用

1) AmdU（5-叠氮甲基-2'-脱氧尿苷） ——一种含有叠氮化物的核苷，可以通过细胞聚合酶掺入新生 DNA 中。然后以这种方式连接到 DNA 上的叠氮基团可以用炔烃或环炔烃进行修饰。

2)叠氮化物-PEG2-醛— 具有叠氮基和脂肪醛部分的连接体。

3)叠氮-PEG3-OH — 它是一种双功能分子，具有叠氮基团、伯醇和其间的亲水连接基团。

4) NHS 叠氮基丁酸酯— 用于肽和蛋白质的叠氮基标记的活化酯

5)生物素 PEG3 叠氮化物— 生物素叠氮化物和亲和探针可以用生物素标记以进行点击化学。

6) Chloro-PEG3-azide — 它是一种带有活性氯的异双功能连接体，用于各种亲核基团的烷基化。

7)碘-PEG3-叠氮化物——碘-PEG3-叠氮化物含有高反应活性的碘化物官能团，可以使各种以C-、O-、N-、S-为中心的亲核试剂与其他亲核试剂发生烷基化。

2.炔基修饰试剂（非荧光炔烃）的用途

1)乙炔酰肼——一种含有炔基和酰肼官能团的双官能试剂。与醛、酮反应，通过CuAAC反应，炔基与各种叠氮化物偶联。

2)炔马来酰亚胺——用于连接炔烃、官能团、蛋白质、肽和其他带有SH(硫醇)基团的分子，包括半胱氨酸残基。

3)炔烃 NHS 酯（NHS 己酸酯） — 炔烃 NHS 酯用于带有炔基的生物分子标记，用于铜催化的点击化学。

4)生物素炔——它是一种反应性亲和标记，可以通过点击化学附着到生物分子上。

5）DBCO NHS酯——偶氮苯并环辛炔（DBCO，ADIBO）试剂具有NHS酯功能，可以将环辛炔连接到各种分子上。

6) EdU（5-乙炔基-2'-脱氧尿苷） ——一种核苷，可以通过细胞酶掺入复制的 DNA 中。细胞中含有的 DNA 可以通过与荧光染料叠氮化物的点击化学反应来显色，以揭示细胞增殖情况。

7) STP己酸酯——炔基活化酯，用于修饰氨基。 STP 酯基是 NHS 酯官能团的替代品。

8) STP 戊酸酯— 一种活化酯，用于将炔烃引入肽/蛋白质中。

蛋白质药物中的聚乙二醇修饰试剂的使用

改性PEG也称为改性聚乙二醇，是通过化学修饰基团或生物活性基团进行修饰的PEG。在药物开发和研究中，为了增加蛋白质或肽药物在体内的半衰期，降低免疫原性，同时增加药物的水溶性，将活化的聚乙二醇与蛋白质、肽、小分子化学偶联。分子有机药物和脂质体。药物经过PEG修饰后，往往具有以下优点：

1）半衰期较长
2）最高血药浓度较低
3）血药浓度波动小
4）酶降解较少
5）免疫原性和抗原性较小
6）毒性较小
7）溶解度较好
8）减少用药频率
9）提高患者依从性，改善提高生活质量，降低治疗费用
10）脂质体对肿瘤有更强的被动靶向作用

修饰PEG的用途介绍：

1.蛋白质药物的PEG修饰

PEG修饰的蛋白质药物可以延长药物的半衰期，降低免疫原性，并最大限度地保留其生物活性。作为治疗药物，用聚乙二醇（PEG）修饰的蛋白质比未修饰的蛋白质更有效。 PEG修饰蛋白质药物主要包括氨基修饰（包括N端氨基酰化修饰、赖氨酸侧链氨基酰化修饰、N端氨基烷基化修饰）、羧基修饰、巯基修饰。
PEG还可修饰蚓激酶、SOD、胰凝乳蛋白酶、G-CSF、pal酶、蛋白A、蛋白B、蛋白半胱氨酸等。

2.肽类化合物的PEG修饰

PEG修饰的肽类化合物，如边界降钙素、表皮生长因子的PEG修饰产物，比原型药物具有明显更高的半衰期和生物活性。尤其是在聚乙二醇的位点特异性修饰方面，肽类化合物比蛋白质更容易实现。在肽化合物的PEG修饰研究中最常见的应用是mPEG。

3.PEG修饰脂质体

脂质体是目前将各种药物转运至细胞内有效的载体之一。常见的免疫脂质体在血液中的循环半衰期短，且易于消除，限制了其发展。 PEG修饰的长循环脂质体不仅可以逃避网状内皮系统的捕获， 而且可以通过增加脂质体的血液循环时间来提高脂质体的被动靶向性。已广泛应用于脂质体药物制剂中。 PEG修饰的阿霉素脂质体比原药心脏毒性小，增加了患者耐受性，在体内起到控释和靶向药物的作用。

4. PEG修饰的有机小分子药物

小分子药物很多，其中大部分是抗肿瘤药物。利用PEG修饰技术，聚乙二醇支持小分子，可以将其许多优异的性质转移到缀合物上。其中，该聚合物具有优异的生物相容性，可溶解于体内组织液中，并能快速排出体外，无任何毒副作用。许多抗肿瘤药物都是通过高分子量PEG进行修饰，以实现被动靶向药物递送至肿瘤组织。PEG修饰方法主要是将PEG与这些小分子药物上的-OH、-NH2、-COOH偶联。如果待修饰的小分子药物不具有这些官能团，可以通过化学方法引入。

5.其他应用

PEG 修饰的亲和配体和辅因子用于水性两相分配系统，用于生物大分子和细胞的纯化和分析。 PEG修饰的碳水化合物可作为新的药物材料和药物载体。寡核苷酸聚乙二醇化可以增加溶解度、增加对核酸酶的抵抗力和细胞膜渗透性。生物材料的聚乙二醇化可以减少血栓形成并减少蛋白质和细胞粘附。