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ibtsystems:人类蛋白质印迹试剂盒详细介绍

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ibtsystems:人类蛋白质印迹试剂盒详细介绍

人类蛋白质印迹试剂盒<br />（猪、牛、山羊、绵羊、豚鼠、兔、驴）IGFBP

适用于人类和其他物种 IGFBP 的蛋白质印迹试剂盒

与猪、牛、山羊、绵羊、豚鼠、兔、驴 IGFBP 发生反应

 

用于检测 IGFBP 的非放射性蛋白质印迹试剂盒

应用说明 IGF0018：

 

人蛋白质印迹试剂盒

检测人类样本中的 IGFBP 和 IGF 受体。牛、猪、兔、豚鼠、绵羊、驴和山羊血清样品也获得了类似的结果。大鼠和小鼠血清在硝酸纤维素膜上仅获得微弱条带（参见：小鼠/大鼠蛋白质印迹试剂盒）。

套件内容：

试剂盒的试剂足以制备每个步骤中每种试剂250ml。这足以容纳 500 平方厘米的印迹膜。试剂盒中的每种试剂也可单独购买。

Reagent Description Quantity Product Code
A 0.5 ml Biotinylated ligand: biotinylated human IGF-II, dilute 1 : 100 to 1 : 500 10 ug BioIGF2-10
B Quenching Buffer, 2-fold conc. 125 ml  QB-125
C Blocking/Dilution Buffer, 10 – fold conc. 75 ml BDB-75
D Washing Buffer, 20-fold conc.  125 ml Product Code: WB-125
E Streptavidin-POD-Conjugate,
dilute 1:2500 – 1:5000		 125 µl Product Code: SPCON
Detailed working instructions Application Note IGF005
Human Western-ligand Blot 1 Kit Product Code: human-WLB

我们的套件不提供基材，您可以使用常用的基材

我们已经成功测试了其他基材，例如 KPL、Pierce、GE Healthcare、Seramun、Kem-en-tec。

使用您自己的缓冲区的注意事项

我们开发了一种缓冲系统，使我们手中的硝酸纤维素膜具有最佳的灵敏度，并且即使在室温下也具有长期的稳定性。也可以使用其他缓冲区，但有一些限制：

  1. 如果您使用牛血清白蛋白 (BSA) 进行封闭和/或稀释，请注意其质量。许多 BSA 制剂含有微量 IGFBP，这可能会影响 WLB 的质量（背景/信号比）。

  1. 文献中描述牛奶含有生物素化蛋白质，这可能会影响 WLB 的质量（背景/信号比）。我们测试了来自不同供应商和当地超市的脱脂奶粉，没有发现生物素化蛋白质。

蛋白质印迹与 ELISA：这两种测试中哪一种对于 HIV 检测最准确？

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蛋白质印迹与 ELISA：这两种测试中哪一种对于 HIV 检测最准确？

如今，先进的医学研究和创新的分子技术可以有效地控制、治疗甚至治愈许多致命疾病。其中包括人类免疫缺陷病毒，俗称艾滋病毒，顾名思义，它会攻击我们的免疫系统。人们经常将艾滋病毒与艾滋病相混淆，艾滋病毒会发展成艾滋病——如果不及时治疗，这是一种致命的疾病。

定期检测和早期诊断表明预防和治疗艾滋病毒的可能性更大，从而避免其发展为艾滋病。 HIV 的早期识别需要引起重视，因为该病毒在第一阶段（急性 HIV 感染）具有高度传播性。

Western Blot和 ELISA 检测已成为许多实验室 HIV 检测的黄金标准。今天，我们详细介绍了这两种实验室检测方法，并对它们进行比较，以了解哪种方法对于艾滋病毒检测最准确。

但在此之前，我们先快速回顾一下我们所做的事情。

Helvetica Health Care (HHC)是提供高质量和重要实验室检测产品的值得信赖的品牌。我们以 ZeptoMetrix WESTERN BLOT 技术而闻名，用于体外检测血清或血浆中的 SIV（猿免疫缺陷病毒，与人类 HIV 最密切相关的慢病毒）抗体，有 10 条或 30 条试剂盒形式可供选择。

我们还提供各种可与分离孔配合使用的 ELISA 试剂盒，包括

• RETROTEK™ 系列设计用于检测和定量细胞培养物、血清、血浆或其他生物液体中的逆转录病毒 HIV-1、SIV 和 HTLV 的逆转录病毒抗原

• IMMUNOTEK™ 试剂盒可以检测和定量许多物种的各种免疫球蛋白，包括人类、鸡、牛、山羊、兔、大鼠和小鼠。我们还提供 HHV-6 IgG 抗体和 KSHV/HHV8 IgG 抗体 ELISA 试剂盒。

现在我们已经掌握了专业知识，让我们来看看两种常用的 HIV 检测方法——ELISA 和蛋白质印迹。

什么是酶联免疫吸附测定？

酶联免疫吸附测定或 ELISA 是一种广泛使用且经济实惠的测试，可帮助科学家研究抗体、抗原、蛋白质和糖蛋白。它是免疫测试的选择，因为它超级灵敏且简单。研究人员经常使用 ELISA 来确定尿液、血清或细胞培养物等样品中是否存在某些蛋白质。 ELISA 对于检测血液样本中的 HIV 抗体和抗原非常有用。

免疫系统会产生某些称为抗体的蛋白质，帮助我们的身体对抗疾病。当体内存在病毒等异物时，我们的免疫系统会做出反应，产生抗体。另一方面，抗原是身体遇到并免疫系统做出反应的任何异物。

什么是蛋白质印迹？

蛋白质印迹，称为蛋白质免疫印迹，是一种常见的细胞和分子生物学技术。它用于查明样品中是否存在某些蛋白质，确定它们的大小和相对强度，从而可以指示 HIV 感染的阶段。

HIV ELISA 检测如何进行？

ELISA 是通过检查人体针对病毒产生的蛋白质来检测 HIV 抗体的典型测试方法。病毒蛋白抗原将与血液样本一起包含在盒中。如果血液中含有 HIV 抗体，它们会与抗原结合并改变盒内内容物的颜色。第一个常用的艾滋病毒检测就是这种非常敏感的检测。

酶联免疫吸附试验 (ELISA) 高度灵敏，是第一个、并且仍然是检测 HIV 时使用广泛的诊断技术。 ELISA 测试通常在 96 孔测试板中进行，这意味着每次运行都可以进行大量测试，使其快速且经济高效。 ELISA 测试也非常适合自动化，许多实验室现在采用全自动机器人系统。

蛋白质印迹技术在 HIV 检测中的作用是什么？

通常，实验室会在 ELISA 之后运行蛋白质印迹程序以确认阳性检测结果。然而，由于替代测试变得更值得信赖并提供更快的诊断，因此不太推荐使用蛋白质印迹测试。

在这项技术中，血液样本的采集方式与 ELISA 测试相同，但收集的样本随后被电流分开并转移到吸墨纸上。在这里，添加酶会导致颜色变化，表明HIV 抗体的存在。

正如我们之前所指出的，在第一阶段或急性感染阶段检测艾滋病毒至关重要，因为与确诊的艾滋病毒患者相比，这一时期艾滋病毒从一个人传播到另一个人的风险更高。尽管蛋白质印迹法过去是分子诊断的黄金标准，但由于以下限制，较少推荐使用：

  • 无法检测急性感染

  • HIV-2 感染可能被错误分类为 HIV-1 感染

  • 由于需要批次或需要外包样品进行测试而导致实验室流程延迟

  • 在血清转化的急性和早期阶段可能出现假阴性或不确定的结果。

  • 解释结果有困难。

HIV 检测中 ELISA 与蛋白质印迹法的比较

当比较 ELISA 和蛋白质印迹法进行 HIV 检测时，在血液筛查方面，ELISA 测定法在成本、效率和实用性方面远远优于蛋白质印迹法。  

随着疾病数量的增加，我们必须强调检测的重要性，这是对患者进行有效健康管理的第一步。如果您是实验室或实验室技术人员，让我们帮助您使您的实验室流程更加准确和高效。


使用 3Dye 差异蛋白质组试剂进行蛋白质标记

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使用 3Dye 差异蛋白质组试剂进行蛋白质标记

差异蛋白质组学可以比较来自不同生物来源的大量蛋白质。通常的例子是经过处理和未经处理的细胞、不同的细菌菌株。即使蛋白质谱中的微小差异也可以通过差异蛋白质组学来发现。

Lumiprobe 3Dye 套件包含 Cyanine2、Cyanine3 和 Cyanine5 染料，它们的光谱不同，但迁移率匹配。因此，用这些染料标记的蛋白质在凝胶电泳中共同迁移。由于使用染料进行的蛋白质标记依赖于 NHS 酯化学，因此赖氨酸残基是标记的主要位点。

二维蛋白质组学的最佳实践意味着使用合并的内部对照样本，该样本本质上是在一个实验中分析的两个样本的混合物。内部对照样品用 Cyanine2 标记，分析样品用 Cyanine3 或 Cyanine5 标记（这两种染料可以互换）。

3Dye 试剂以 5 nmol、10 nmol 和 25 nmol 包装进行预先测量。染料被冻干以延长其保质期。每个包装在使用前均应用 DMF 重新配制。 DMF 质量对于实验和产品保质期至关重要。套件中的染料附带 DMF。

蛋白质混合物的制备是测定中变化最大、要求最高的部分。它超出了协议的范围，因为不同的样品需要非常不同的裂解条件才能获得适合检测的蛋白质混合物。本质上，被比较的两个样品应该在相同的条件下裂解以获得有意义的结果。一般来说，如果实验需要裂解，建议使用基于 CHAPS 的裂解溶液。

在比较两种蛋白质混合物的制备后，可以使用以下方案来实现标记：

  1. 通过每 1 nmol 每种染料添加 1 μL DMF（来自试剂盒），制备每种染料的 1 mM 库存溶液。这些溶液在 -20°C 下可稳定保存三个月。为了确保保质期，在打开前将管干燥、全解冻，在关闭前尽可能用惰性气体吹扫。

  2. 使用无胺缓冲液（NaHCO3、醋酸盐）或 Tris 缓冲液将蛋白质混合物 pH 调节至 8.5。在单独的小瓶中，准备三个用于标记的蛋白质样品：(1) 第一个蛋白质样品，(2) 第二个蛋白质样品，以及 (3) 两者的混合物（合并的内部对照）。每个样品中的蛋白质浓度理想情况下应为 5–10 mg/mL，但也可以使用低至 1 mg/mL 的浓度。每次反应取 50 μg 蛋白质。

  3. 通过取等分的 1 mM 库存溶液并用 DMF 稀释至 0.4 mM 来制备染料工作溶液。

  4. 将 1 μL 工作染料溶液添加到反应混合物中：Cyanine3 表示未处理，Cyanine5 表示处理过（反之亦然），Cyanine2 表示合并的内部对照。通过移入和移出混合每个反应，并在黑暗中放置 30 分钟。

  5. 通过向每种溶液中添加 1 μL 10 mM 赖氨酸来停止反应（试剂盒中不包含该试剂，但该试剂很容易获得）。

  6. 合并三个样品并运行 2D 凝胶。

  7. 使用任何能够检测 Cyanine2、Cyanine3 和 Cyanine5 的成像仪进行分析。可以从凝胶上切下蛋白质斑点并通过质谱分析。

使用 LumiZol 试剂快速分离 RNA、DNA 和蛋白质

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使用 LumiZol 试剂快速分离 RNA、DNA 和蛋白质

LumiZol Reagent 设计用于从各种来源（植物、动物、细菌和酵母）的细胞和组织样品中快速分离 RNA、DNA 和蛋白质。 LumiZol Reagent 是一种含有苯酚、异硫氰酸胍以及分离高质量核酸和蛋白质所需的其他成分的溶液。苯酚和异硫氰酸胍可裂解细胞并有效抑制核糖核酸酶，从而保持 RNA 完整。均质化并添加氯仿后，样品分离成上层水相、中间相和下层有机相。 RNA 可以用异丙醇从上相沉淀，而 DNA 和蛋白质可以分别用乙醇和异丙醇从中间相和下层有机相沉淀。

用于 RNA、DNA 和蛋白质分离的样品：

  • 植物和动物组织——30-100毫克；

  • 贴壁真核细胞 — 1×10 5至 1×10<sup7< sup=”” style=”box-sizing: border-box;”>;

  • 悬浮真核细胞、酵母 — 5×10 6至 10×10 6；

  • 细菌细胞 — 1×10 7。

RNA分离

使用新鲜或液氮速冻样品以获得最佳 RNA 分离效果。在 LumiZol 试剂中均质化之前，请勿解冻样品。

  1. 根据您的起始材料在 LumiZol 试剂中裂解样品：

    • 组织：在 1 mL LumiZol 试剂中匀浆组织样本，并将匀浆转移至新的 1.5 mL 管中。

    • 细胞：弃去培养基，用 0.5–1 mL LumiZol 试剂重悬细胞沉淀或单层细胞，然后将裂解物转移至新的 1.5 mL 试管中。

  2. （可选）如果样品脂肪含量高，则将裂解液在 4 °C 下以 12,000 × g 离心 5 分钟，然后将上清液转移至新的 1.5 mL 管中。

  3. 将管在室温下孵育 5 分钟。

  4. 向裂解液中添加 0.2 mL 氯仿（每 1 mL 用于裂解的 LumiZol 试剂），通过翻转管充分混合，并在室温下孵育 2 分钟。

  5. 将管在 4°C 下以 12,000 × g 离心 15 分钟。离心后，混合物分成两相：无色水相和黄色有机相，其间有中间相。

  6. 将上层水相转移至新的 1.5 mL 管中，不要接触间相。如果样品中RNA的量非常少，则在水相中添加共沉淀剂。保留有机相和界面用于 DNA 和蛋白质提取。

  7. 向水相中加入0.8体积的异丙醇，充分混合，并在室温下孵育10分钟。

  8. 将管在 4°C 下以 12,000 × g 离心 10 分钟。

  9. 弃去上清液，向 RNA 沉淀中加入 1 mL 70% 乙醇，充分混匀，并在 4 °C 下以 7,500 × g离心管 5 分钟。

  10. 弃去上清液，将 RNA 沉淀风干 5-10 分钟。

  11. 将 RNA 沉淀溶解在 50–100 μL 无 RNase 水中。

DNA分离

  1. 除去“RNA 分离”部分步骤 5 中获得的界面上的任何剩余水相。

  2. 向界面相和有机相中添加 0.3 mL 100% 乙醇（每 1 mL 《RNA 分离》步骤 1 中使用的 LumiZol 试剂），通过翻转管混合，并在室温下孵育 2-3 分钟。

  3. 将管在 4 °C 下以 2,000 × g 离心 5 分钟。将上清液转移至新的 1.5 mL 管中。上清液可用于后续的蛋白质提取。

  4. 将 DNA 沉淀重悬于 1 mL 柠檬酸钠/乙醇溶液（10% 乙醇中的 0.1 M 柠檬酸钠，pH 8.5）中。

  5. 孵育 30 分钟，偶尔混合。

  6. 将管在 4 °C 下以 2,000 × g 离心 5 分钟。丢弃上清液。

  7. 再重复一次步骤 4-6。

  8. 将 1 mL 70% 乙醇添加到 DNA 沉淀中，充分混匀，然后在 4 °C 下以 2,000 × g离心管 5 分钟。

  9. 弃去上清液，将 DNA 沉淀风干 5-10 分钟。

  10. 将 DNA 沉淀重悬于 0.3–0.6 mL 的 8 mM 氢氧化钠中。

  11. 将管在 4 °C 下以 12,000 × g 离心 10 分钟，将上清液转移至新的 1.5 mL 管中，并用 Tris-HCl 缓冲液将 pH 调节至 7–8 [添加 5 μL 1 M Tris-HCl 缓冲液（pH 4.5）至300μL DNA溶液]。

蛋白质分离

  1. 向《DNA 分离》部分第 3 步获得的上清液中添加 1.5 mL 异丙醇（每 1 mL 《RNA 分离》步骤 1 中使用的 LumiZol 试剂），通过翻转管充分混合，并孵育 10分钟在室温下。

  2. 将管在 4°C 下以 12,000 × g 离心 10 分钟。丢弃上清液。

  3. 将蛋白质沉淀重新悬浮在 2 mL 盐酸胍/乙醇溶液（0.3 M 盐酸胍于 95% 乙醇中）中。

  4. 将管在室温下孵育 20 分钟。

  5. 将管在 4 °C 下以 7,500 × g 离心 5 分钟。丢弃上清液。

  6. 再重复步骤 3-5 两次。

  7. 向蛋白沉淀中加入 2 mL 100% 乙醇，充分混匀，室温孵育 20 分钟。

  8. 将管在 4 °C 下以 7,500 × g 离心 5 分钟。丢弃上清液。

  9. 将蛋白质沉淀风干 5-10 分钟。

  10. 将蛋白质沉淀溶解在含有 SDS 的缓冲液中（例如，用于将蛋白质样品加载到聚丙烯酰胺凝胶上的样品缓冲液）。

使用 ProteOrange 进行蛋白质凝胶染色

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使用 ProteOrange 进行蛋白质凝胶染色

ProteOrange 染料可以在聚丙烯酰胺凝胶中电泳后快速、轻松地可视化蛋白质。 ProteOrange 是一种二苯乙烯型荧光团，含有两性离子片段。在核酸、多糖和其他分子存在的情况下，蛋白质/十二烷基硫酸钠胶束 (SDS) 选择性地结合染料。 ProteOrange 可有效对分子量为 6 kDa 及以上的蛋白质进行染色。在三个数量级覆盖的浓度范围内，荧光信号与蛋白质浓度呈线性关系。

ProteOrange 凝胶染色的灵敏度大约是考马斯染色的十倍，但不如银染色敏感。对于 ProteOrange，检测限为每条带 3 ng 蛋白质（考马斯的检测限约为 30 ng，银染的检测限约为 0.5 ng）。然而，与银染相比，ProteOrange 染色的方案要简单得多，因为它不需要洗涤，也不需要标准 SDS-PAGE 的固定。实验流程需要 30-60 分钟才能完成，包括在含有染料的 7.5% 乙酸水溶液中孵育凝胶，以及用 7.5% 乙酸短暂冲洗凝胶 30 秒。应使用波长为 312-365 nm 的透射仪进行可视化。 ProteOrange 库存溶液在室温下避光保存。

协议

  1. 确保染料原液不含沉淀物。如果不是这种情况，请将试剂在 70 °C 下保持几分钟，直至沉淀物全溶解，然后摇动小瓶。

  2. 准备染料的工作溶液。准备的量取决于凝胶块的大小和托盘尺寸。例如，25 mL 的溶液足以制备 10 × 15 cm 的凝胶片。要制备此溶液，请将 1.88 mL 冰醋酸溶解在 23 mL 水中，制成 7.5% 乙酸，并添加 5 μl 5000x ProteOrange 溶液。搅拌均匀，避光保存不超过三小时。

  3. 电泳结束后，将凝胶放入托盘中，加入染料工作液，避光孵育20-60分钟（对于较薄的凝胶或较低百分比的凝胶，应缩短时间；对于1 mm的凝胶，60分钟最佳厚，15% 凝胶）。染料的工作溶液只能使用一次，因为重复使用会导致灵敏度降低。

  4. 用 7.5% 乙酸溶液（不含染料）冲洗凝胶 30 秒。凝胶已准备好进行可视化。

  5. 为了可视化，将凝胶放在透照仪上。

  6. 要去除染料，请将凝胶在 0.1% Tween 20 溶液中孵育 10-12 小时，或用 7.5% 乙酸溶液反复清洗。

笔记

  • 为了提高灵敏度，我们建议在 TGB 缓冲液中添加 0.05% SDS（相对于标准 0.1%）进行电泳。 SDS 浓度的这种变化不会影响蛋白质的迁移率，但会缩短染色时间。

  • 在含有甲醇/乙醇的溶液中染色之前不要固定凝胶。

  • 对于小蛋白质或低百分比凝胶，应选 10% 乙酸溶液。

  • 该染料不适用于将蛋白质转移到膜上后对其进行染色。

  • 如果凝胶用于蛋白质印迹，ProteOrange 染色可以在标准转运缓冲液中进行，但这会导致灵敏度下降。

  • 对于 Triton X-100 凝胶电泳，电泳完成后立即在 Triton X100 不含 TGB 缓冲液中清洗凝胶（3×20 分钟），然后不久将凝胶在添加了 0.05% SDS 的 TGB 缓冲液中孵育 30 分钟，然后进行染色。

  • 为了在电泳过程中对蛋白质进行染色，ProteOrange 应溶解在上层（阴极）缓冲液中。电泳结束后，将凝胶在 7.5% 乙酸溶液中孵育 30 分钟，以降低荧光背景水平。

  • 无需 SDS 即可对凝胶进行染色，但该方法的灵敏度会降低，并且灵敏度很大程度上取决于蛋白质的氨基酸组成。除非电泳后应回收天然蛋白质，否则凝胶应在含有 0.05% SDS 的缓冲液中孵育，并根据标准方案进行染色。

  • 通常，预染色的蛋白梯用 ProteOrange 进一步染色时不会发出荧光。仅使用未染色的梯子。

  • 用 ProteOrange、考马斯染色或银染色后仍然可以进行。

蛋白质和硫醇化生物分子的马来酰亚胺标记

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蛋白质和其他硫醇化生物分子的马来酰亚胺标记

硫醇与马来酰亚胺的反应是广泛用于生物共轭和标记生物分子（包括蛋白质和肽）的过程。它按照以下方案进行：

蛋白质和硫醇化生物分子的马来酰亚胺标记

马来酰亚胺是对硫醇表现出高选择性的亲电子化合物。虽然马来酰亚胺在自然界中几乎不存在，但硫醇却非常丰富。它们以半胱氨酸残基形式存在于蛋白质和肽中。尽管天然DNA不含硫醇，但具有硫醇基团的合成寡核苷酸可以很容易地制备。

硫醇易于氧化二聚并形成二硫键。因此，半胱氨酸残基形成二硫键，从而稳定蛋白质的三级结构。二硫化物不与马来酰亚胺反应。因此，有必要在缀合前还原二硫化物并排除反应中的氧气。

缀合方案取决于起始组分的溶解度。对于水溶性较低的化合物（如大多数荧光染料马来酰亚胺），必须使用有机共溶剂（如 DMSO或 DMF）。

我们建议采用以下方案将Lumprobe 染料马来酰亚胺与蛋白质、肽和其他硫醇化生物分子结合。

  1. 将待标记的蛋白质或其他含有硫醇的分子溶解在塑料小瓶中的脱气缓冲液中，pH 7-7.5（PBS、Tris 和 HEPES 很好，但也可以使用其他不含硫醇的缓冲液）。可以通过在缓冲液上施加真空几分钟或通过惰性气体（氮气、氩气或氦气）鼓泡来对缓冲液进行脱气。对于蛋白质，最佳浓度为 1-10 mg/mL。

  2. 添加过量的 TCEP（三羧乙基膦）试剂以减少二硫键，用惰性气体冲洗并关闭。 TCEP 过量 100 倍就可以了。将混合物在室温下放置 20 分钟。

  3. 将马来酰亚胺染料溶解在 DMSO 或新鲜 DMF 中（100 uL 中 1-10 mg）。

  4. 将马来酰亚胺染料溶液添加到硫醇溶液中（染料过量 20 倍），用惰性气体冲洗小瓶，然后紧紧关闭。

  5. 充分混合并在 4°C 或室温下放置过夜。

  6. 通过凝胶过滤、HPLC、FPLC 或电泳纯化产物。

对于水溶性差的马来酰亚胺，像大多数染料马来酰亚胺一样，我们建议使用共溶剂（DMF 或 DMSO）。具有良好水溶性的马来酰亚胺（如磺基-氰基马来酰亚胺）可以溶解在水中。如果出现沉淀，请增加混合物中有机助溶剂的含量，以实现更好的标记。

建议仅将透析作为纯化具有良好水溶性的马来酰亚胺的方法。

聚焦蛋白质氧化：二溴酪氨酸

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聚焦蛋白质氧化：二溴酪氨酸

什么是二溴酪氨酸？ 二溴酪氨酸是一种相对较新的生物标志物，表明氧化应激介导的蛋白质增强。当中性粒细胞中的髓过氧化物酶 (MPO)和嗜酸性粒细胞中的嗜酸性粒细胞过氧化物酶 (EPO) 催化过氧化氢(H2O2)和溴离子 (BR-) 离子形成次溴酸 (HOBr) 时，就会形成最终的生物标志物。生成的 HOBr 导致酪氨酸 3 和 5 位被 Br 取代。

二溴酪氨酸研究兴趣

二溴酪氨酸被认为是哮喘和类似疾病的可能的诊断生物标志物。(1-3)
最近，研究人员研究了二溴酪氨酸在心肌梗塞和中风动物模型中研究缺血再灌注相关组织损伤问题的有用性。

二溴酪氨酸 (DiBrY) 抗体：克隆 3A5 (20 µg)


中性粒细胞和嗜酸性粒细胞在抵抗微生物感染的防御系统中发挥着重要作用。已知髓过氧化物酶（MPO）和嗜酸性粒细胞过氧化物酶（EPO）可催化次氯酸（HOCl）和次溴酸（HOBr）的形成。这些反应中间体可能与蛋白质、脂质和核苷酸发生反应，据报道会形成酪氨酸卤化物，例如二溴酪氨酸（DiBrY）。 DiBrY 是 3- 和 5- 位 Br 修饰的酪氨酸，是中性粒细胞髓过氧化物酶衍生的主要氧化产物之一。

聚焦蛋白质氧化：二溴酪氨酸

蛋白质印迹实验方案

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蛋白质印迹实验方案

裂解缓冲液：

为了准备在凝胶上运行的样品，需要裂解细胞和组织以释放感兴趣的蛋白质。这会溶解蛋白质，使它们可以单独迁移通过分离凝胶。我们使用 RIPA 缓冲液 (beyotime P0013B) 来提取全细胞提取物和膜结合蛋白。

蛋白酶和磷酸酶抑制剂：

一旦发生裂解，蛋白水解、去磷酸化和变性就开始。如果样品始终保存在冰上或 4°C 下，并且将适当的抑制剂新鲜添加到裂解缓冲液中，这些事件可以大大减慢。 Pmsf是我们经常使用的蛋白酶抑制剂。

组织裂解液的制备

用干净的工具解剖感兴趣的组织，最好在冰上，并尽可能快地防止蛋白酶降解。均质化前应将 RIPA（含 1mM pmsf）冰冷。

将组织切成小片，对于约 20 mg 的组织，将约 250 μl 裂解缓冲液快速加入管中，用电动匀浆器（或玻璃匀浆器）匀浆直至全裂解。

在微量离心机中于 4°C 下以 10000~14000g 离心 5 分钟。轻轻地从离心机中取出管子并置于冰上，吸出上清液并置于冰上保存的新管中；丢弃颗粒。

蛋白质浓度的测定：

使用 PAGE 凝胶、Bradford 测定、Lowry 测定或 BCA 测定。牛血清白蛋白（BSA）是一种常用的蛋白质标准品。

制备用于加载到凝胶中的样品：

要变性，请使用带有阴离子变性去污剂十二烷基硫酸钠 (SDS) 的上样缓冲液，并将混合物在 95-100°C 下煮沸 5 分钟。

    1. 清洁玻璃并设置电泳系统。

    2. 制备PAGE胶，根据蛋白质的分子量选择不同浓度的分离胶：

蛋白质大小 (kDa) 凝胶百分比(%)
4-40 20
12-45 15
10-70 12
30-100 10
50-200 8

  1. 4%堆积胶，选择预染色的蛋白质Marker Proteins的大小，以帮助区分蛋白质大小和电泳示踪剂。

  2. 上样跑胶，每孔加样量20-40μg蛋白，加样时注意不要溢出到相邻孔中，造成胶戳孔和交叉污染。

  3. 按照电泳方法推荐的说明进行电泳，当溴酚蓝将凝胶耗尽时终止凝胶电泳。

  1. 将蛋白质从凝胶转移到膜上。 （根据trans-blot系统推荐的说明。）

  2. 查看膜中的蛋白质：丽春红。转印后，用丽春红染料染色约2～5min，检查转印是否成功。然后用蒸馏水冲洗掉染料。

  3. 封闭膜一般用5%脱脂牛奶，或3%~5% BSA。 4 ℃摇床振荡封闭过夜，或37 ℃封闭2小时。封闭后TBS洗涤5-10秒。 

  4. 与一抗一起孵育。按照推荐的抗体稀释度，用TBST（或1%~3%脱脂牛奶）稀释抗体。然后将膜装入自封袋和固定层压机中，将抗体溶液添加到自封袋中，并确保膜与足够体积的抗体一起孵育。

  5. 37℃振荡孵育1～3 h（根据抗体效价和亲和力），或4℃过夜孵育，TBST室温摇床上洗3次，每次5～10 min。

  6. 与二抗孵育，同步骤(4)，用TBST稀释，37℃振荡孵育1～3 h。

HRP 偶联抗体的化学发光、显影和固定：ECL 是使用的传统试剂盒。

在暗室中，将显影剂和固定剂分别装入塑料托盘中，在离心管中混合两种试剂（A 和 B 的体积）。确保膜表面蛋白与混合物充分接触。 1~2分钟后去除残留物。

红灯处取出胶片，打开胶片夹，将胶片放在胶片上，取下胶片夹，根据信号强度调整曝光时间，记住曝光过度的胶片不适合分析。

曝光完成后，取出胶片，迅速浸入显影液中，终止显影。显影后，应立即将胶片浸入定影液中成透明膜。用自来水清洗除去残留的固定剂后，在室温下干燥。 

常见蛋白质印迹问题的提示和技巧

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常见蛋白质印迹问题的提示和技巧

蛋白质印迹是研究实验室普遍使用的一种技术，用于研究感兴趣的蛋白质。蛋白质印迹用于抗体验证、蛋白质-蛋白质相互作用研究以及许多其他应用。1然而，生成可解释的蛋白质印迹结果可能具有挑战性。以下是一些常见问题以及解决方法。

高背景

可能是由于 尝试这个
高抗体浓度 使用一抗和二抗进行滴定。包括已知的蛋白质对照。
封闭液 使用新鲜的封闭液，增加封闭时间/温度，尝试不同的封闭剂。
印迹在封闭/洗涤过程中干燥 确保膜在封闭和清洗步骤中被充分覆盖。
洗得不够 增加洗涤次数和洗涤液体积。确保至少洗涤 3 次，每次 5 分钟。
胶片曝光过度 尝试较短的曝光时间。

没信号

可能是由于 尝试这个
抗体浓度太低 使用一抗和二抗进行滴定。包括已知的蛋白质对照。
样品中目标含量低 增加凝胶上的蛋白质浓度。建议滴定。
一抗和二抗不匹配 确保二抗针对一抗的宿主物种。
转移问题 使用带有颜色的蛋白质标记来检查转移。使用对照蛋白优化转移。转移前检查是否有气泡。
洗次数太多 减少洗涤次数。

多频段

可能是由于 尝试这个
凝胶超载 滴定加载在凝胶上的蛋白质样品。
使用过多抗体 使用一抗和二抗进行滴定。包括已知的蛋白质对照。
胶片曝光过度 尝试较短的曝光时间。
阻塞问题 使用新鲜的封闭液，增加封闭时间/温度，尝试不同的封闭剂。
目标蛋白的翻译后修饰 研究发表了目标蛋白翻译后修饰的例子，可以提供生物学解释（即磷酸化、糖基化、核糖基化）。
翻译后裂解 许多蛋白质被合成为前蛋白质，然后被切割成活性形式，例如前半胱天冬酶。研究针对您的目标发布的示例。
拼接变体 选择性剪接可能会产生由同一基因产生的不同大小的蛋白质。研究针对您的目标发布的示例。

什么是蛋白质结构分析

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什么是蛋白质结构分析

蛋白质的功能直接取决于其结构、与其他蛋白质的相互作用以及在细胞、组织和器官中的位置。蛋白质组学对蛋白质的结构和功能进行了大规模研究，这些研究能识别与特定疾病状态相关的蛋白生物标志物，为治疗提供了潜在靶点。通过了解蛋白质结构以及对蛋白质位置、表达水平和相互作用作图得到了有意义的信息，可用于推断蛋白质功能。 

蛋白质结构

蛋白质结构取决于组成蛋白质的氨基酸序列以及蛋白质如何折叠成更复杂的形状。

  • 一级结构由组成蛋白质的氨基酸序列决定。

  • 二级结构由多肽片段的局部间相互作用决定，即通过氢键结合作用形成α-螺旋和β-折叠。

  • 三级结构定义蛋白质的整体三维结构。

  • 四级结构定义多个蛋白质亚基如何相互作用形成更大的复合物。

蛋白质结构测定

在原子分辨率下确定蛋白质三维结构对于阐明蛋白质功能、基于结构的药物设计和分子对接十分有用。

  • NMR：核磁共振（NMR）光谱用于获取有关蛋白质结构和动力学的信息。NMR中，原子的空间位置取决于其化学位移。对于蛋白质NMR，通常用稳定的同位素 (15N,13C,2H)标记蛋白质，增强其灵敏性，便于计算结构去卷积。通常蛋白质表达过程在生长培养基中进行，通过使用同位素标记的营养物引入同位素标记。

  • X射线晶体学：蛋白质的X射线晶体学通过X射线衍射结晶蛋白质可获得蛋白质的三维结构。提高溶液中蛋白质浓度，促进沉淀使晶体生长，并在合适的条件下形成有序的蛋白质晶体。将X射线对准蛋白质晶体，蛋白质晶体将X射线散射到电子检测器或胶片上。旋转晶体捕获三维衍射，可以通过傅立叶变换计算出结晶分子中每个原子的位置。

蛋白质作图

蛋白质在特定细胞、组织和器官中的位置和表达水平的定位有助于蛋白质组学的功能研究。蛋白质的空间结构是决定蛋白质功能的关键，不恰当的定位或表达会触发各种疾病状态。诸如人类蛋白质图谱之类的作图研究项目为发现蛋白质标记物提供了蛋白质组学资源，有助于理解疾病病理学。相互作用组作图有助于定义细胞水平上发生的分子相互作用，有助于理解蛋白质功能，为治疗疾病提供有价值的潜在药物靶点。

蛋白质如何与羧化金纳米颗粒的共价结合

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蛋白质如何与羧化金纳米颗粒的共价结合

金纳米颗粒缀合物已广泛应用于生物研究和生物传感应用。例如，金纳米颗粒可以用作光学或电子显微镜、侧流免疫测定和免疫印迹方案（例如斑点印迹和蛋白质印迹）中的探针。 

制备金缀合物有两种方法，即被动吸附和通过连接体的共价偶联。尽管制备过程相对简单，但蛋白质对金纳米颗粒的被动吸附并不能提供涂层的附着，因为随着时间的推移，分子可能会从表面解吸。此外，在某些情况下，蛋白质在吸附到表面后会失去其特性，这可能是由于三级结构的变化或活性位点/抗原结合位点与金表面的结合使其难以接近而引起的。

尽管存在这些缺点，蛋白质被动吸附到金纳米颗粒上仍然很受欢迎，并且是生成蛋白质金缀合物的简单方法。通过被动吸附到标准球形金纳米粒子来制备金纳米粒子蛋白缀合物，可以使用我们方便的被动吸附金缀合优化套件进行优化。

与被动吸附相比，共价偶联将感兴趣的分子固定在功能化金纳米颗粒上（例如带有NHS、羧基或胺基团）。与被动吸附方法相比，这种方法大大提高了蛋白质涂层的稳定性。共价偶联使用与待缀合分子上的特定化学基团反应的化学接头。因此，该方法比被动吸附方法更具特异性和可控性，并且可以针对特定应用优化共价缀合配体的数量。通过接头的共价偶联还具有最小化空间位阻和对缀合蛋白三级结构的影响的优点。总而言之，这对缀合蛋白的性质产生的有害影响较小。 

我们的羧基金纳米粒子、羧基金纳米海胆和羧基金纳米棒均依赖于 EDC/NHS 化学进行结合。 EDC 和 NHS“激活”颗粒表面的羧基，形成中间体，随后与特定蛋白质或其他待缀合配体上的伯胺基团反应。EDC 缀合的效率通常较低，并且对 pH 值和共价键敏感耦合协议需要一定程度的优化才能实现所需的性能或稳定性。 

以下方案提供了将生物分子与我们的羧化金纳米颗粒偶联的一般指南，以标准 IgG 与我们的 20 nm 羧基金纳米颗粒的偶联为例。对于其他生物分子或纳米粒子类型的缀合，最佳缀合条件可能会有所不同。为了获得与颗粒表面的最大结合，用于结合的蛋白质的量比全覆盖所需的理论量多大约1至10倍。 

所需材料和设备

  • 20nm羧基金纳米粒子 

  • 甲基金纳米粒子（阴性对照）

  • 1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐 (EDC)（Sigma，目录号 E1769）

  • N-羟基磺基琥珀酰亚胺 (Sulfo-NHS)（Sigma，目录号 56485）

  • 阳性对照蛋白：辣根过氧化物酶 (HRP) 或来自人血清的 IgG（Sigma，目录号 I4506）

  • 阻断剂：牛血清白蛋白 (BSA)（Sigma，目录号 A3059）

  • 激活缓冲液：2-(N-吗啉代)乙磺酸 (MES) 缓冲液（10 mM，pH 5.5）

  • 偶联缓冲液：1X 磷酸盐缓冲盐水 (PBS)

  • 洗涤缓冲液：1X 磷酸盐缓冲盐水 + 0.05% Tween 20 (PBST)

  • 紫外可见分光光度计

  • 待缀合的目标蛋白

注意：待缀合的蛋白质必须是纯净的且不含污染蛋白质（例如 BSA）和其他含胺成分。任何其他含有伯胺的分子都可能与待缀合的蛋白质竞争，并可能导致缀合效率显着降低。该蛋白质还应该具有足够的可接近的伯胺基团用于缀合。赖氨酸残基是 EDC 缀合的主要靶位点。 

程序

  1. 如果金纳米粒子的浓度低于OD 50，则通过离心浓缩它们。如果缓冲液中有颗粒，则通过离心在纯水中清洗它们。有关说明，请参阅“金纳米颗粒处理和储存”。

  2. 在 MES 缓冲液中制备浓度分别为 30 和 36 mg/mL 的新鲜 EDC/NHS 混合溶液。请注意，EDC/NHS 在水溶液中会迅速水解，应在结合前新鲜制备。

  3. 取 10 µL 20 nm 金纳米粒子（水中 OD 50）并与步骤 2 中制备的 10 µL EDC/NHS 混合溶液混合。

  4. 室温孵育 30 分钟

  5. 添加 1 mL PBST 并涡旋 

  6. 6,500 g 离心 30 分钟

  7. 除去大部分上清液

  8. 添加 10 µL 抗体（1 X PBS 中 1 mg/mL）*

  9. 在水浴超声仪中超声 10 秒

  10. 室温下搅拌孵育 2 至 4 小时

  11. 添加 1 mL PBST 并涡旋

  12. 6,500 g 离心 30 分钟

  13. 除去大部分上清液

  14. 添加 50 µL PBS 和 1% BSA

  15. 储存于 4 度即可使用

* 蛋白质的浓度可能会根据颗粒大小和要结合的蛋白质而变化。一般来说，蛋白质的量应比全表面覆盖的量多 1 至 10 倍。应估计颗粒的总表面积和对接面积，以计算最佳的蛋白质含量。下表是将 IgG 与不同尺寸的羧基金颗粒结合的一般参考。其他蛋白质的计算类似，但需要计算您感兴趣的蛋白质的对接面积。

表 I.  EDC 缀合期间不同尺寸的羧基金纳米颗粒的 IgG 的建议量。 IgG 分子的对接面积估计为 45 nm2。 “NX全覆盖量”是指孵育量与颗粒表面全覆盖所需量之间的过量比。

蛋白质如何与羧化金纳米颗粒的共价结合

什么是蛋白质印迹？

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什么是蛋白质印迹？

蛋白质印迹是研究蛋白质结构和功能的常用技术。通常，蛋白质样品在 SDS 凝胶上进行电泳，然后转移到固相支持物（硝基纤维素或 PVDF 膜）上，以便随后用特异性抗体进行探测。与 RNA/DNA 印迹技术的进步不同，剥离抗原/抗体并重复使用印迹是很困难的。


印迹的回收具有许多优点：

  • 有效利用数量有限的样品。

  • 比较在同一印迹中使用不同抗体获得的图像。

  • 使用相同或不同的抗体确认结果。

  • 重复使用印迹更加经济且耗时更少。

重复使用蛋白质印迹的想法源于这样的事实：抗原-抗体复合物（例如，免疫亲和柱）可以被破坏并且免疫亲和柱可以多次重复使用。然而，免疫亲和技术中常用的洗脱条件（低或高 pH、使用离液剂）并不能有效地从蛋白质印迹中剥离抗体。

ADI 现在开发了专门配制的解决方案，可以在温和的条件下有效且几乎定量地剥离抗体。它具有以下优点：新型抗体条解决方案的优点

  1. 1. 室温剥离抗体（无需加热）。
  2. 2.无刺激性气味，巯基乙醇。
  3. 3. Strip 溶液为 10X 溶液，可立即使用。只需将印迹浸泡在溶液中 10-15 分钟即可。
  4. 4. 在封闭缓冲液（试剂盒中提供）中短暂孵育后，印迹可在 15-60 分钟内重复使用。

蛋白质印迹 (WB) – 实验方案

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蛋白质印迹 (WB) – 实验方案

蛋白质印迹是一种常用的分子生物学技术，用于分析样品中感兴趣的蛋白质。细胞裂解物由细胞培养物裂解产生，并在凝胶电泳 (SDS-PAGE) 中按重量分离。然后这些蛋白质从凝胶转移到膜上，在膜上它们被封闭并用特异性抗体探测以检测感兴趣的蛋白质。借助灵敏且特异的抗体，可以轻松检测小样品中的修饰蛋白质或未修饰蛋白质。

蛋白质印迹 (WB) – 实验方案

协议：

1. 在封闭液（TBST 中的 5% 脱脂牛奶（50mM Tris、100mM NaCl、0.05% Tween-20，pH 7.6）中振荡孵育 1 小时，封闭膜。

注意：对于磷酸化特异性抗体，使用封闭液中的 5% BSA。

2. 在封闭液中以适当的稀释度稀释一抗。

3. 将膜与稀释的一抗在 40°C 下搅拌孵育过夜。

4. 去除抗体溶液。室温下在 TBST（50mM Tris、100mM NaCl、0.05% Tween-20、pH 7.6）中摇动洗涤膜 3 次，每次 5-10 分钟。

注意：将 Tween-20 浓度增加至 0.1% 可降低背景并提高特异性，但会降低灵敏度。

5. 将膜与在封闭液中稀释（根据制造商说明）的二级 AP 或 HRP 缀合物一起在室温下振荡孵育 1 小时。

6. 按照步骤 4 清洗膜。

7. 在进行化学发光反应之前，用 TBS 清洗膜 2-5 分钟。

8. 根据制造商的说明制备和使用化学发光底物（用于 AP 或 HRP）。

9. 立即包裹膜并在 X 射线胶片下曝光 10 秒至 1 小时。暴露时间可能根据抗体和抗原的量而变化。或者放入成像仪中并进行相应调整。

蛋白质细胞裂解缓冲液（5倍）TBS5001

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蛋白质细胞裂解缓冲液（5倍）

简要描述：蛋白质细胞裂解缓冲液（5倍）（货号：TBS5001） ：上海金畔生物科技有限公司专业提供一站式实验产品，欢迎咨询！

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供货周期 现货

蛋白质细胞裂解缓冲液（5倍）（货号：TBS5001）

细胞裂解缓冲液用于在非变性条件下裂解细胞。

储存条件:

储存在–20℃下。对于短期储存（1-2周），细胞裂解缓冲液可在4℃下储存。

Tribioscience是一家专注于为生命科学研究实验室和公司提供试剂的生物技术公司，是一家私人控股的生物技术公司，由斯坦福大学的一群科学家于2010年创立。公司专注于为分子生物学、生物化学、免疫学、传染病、基因治疗、神经科学、动物实验和药物开发领域的生命科学研究实验室和生物技术公司提供高质量的产品。产品涵盖抗体、生化测试、ELISA试剂盒、PCR及相关试剂等。我们还为生物技术行业和学术界提供CRO（研究合同组织）服务。我们的动物建模服务已被用于动物模型开发和活泼的高排名大学的评估。

蛋白质细胞裂解缓冲液（5倍）（货号：TBS5001）

Claudin18.2 蛋白质介绍

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Claudin18.2 蛋白质介绍

Claudin 是 Furuse 于 1998 年先发现的一个蛋白质家族，该家族至少包含 27 个成员。它是一种四次跨膜蛋白，在上皮和内皮的紧密连接处表达，是紧密连接链的组成部分，在维持细胞极性和信号转导方面发挥着关键作用。Claudin18.2是Claudin18的亚型，据报道仅有限地表达于胃粘膜分化的上皮细胞中，而在多种恶性肿瘤组织中显着表达，如胃癌、胰腺癌、胆管癌、卵巢癌和肺癌等。它已成为免疫疗法的理想靶点，包括单克隆抗体、双特异性抗体、ADC和CAR-T疗法。
受细胞膜表面积和过表达膜蛋白潜在细胞毒性的限制，重组四通Claudin18.2蛋白的表达水平远低于可溶性蛋白。此外，还需要筛选合适的去污剂或脂质，以在提取和纯化过程中保持空间构象和蛋白质活性。这使得获得高纯度、天然构象和活性的Claudin18.2抗原非常困难，这严重阻碍了针对Claudin18.2的药物和疗法的开发。

ACROBiosystems依托多次跨膜蛋白技术平台，成功开发出全长Claudin18.2-VLP和Claudin18.2-DDM/CHS，并通过ELISA/BLI/SPR验证其高生物活性，满足要求的药物开发。