使用点击化学测定细胞增殖和 DNA 复制

细胞增殖测定广泛应用于细胞毒性研究、癌症研究和细胞生物学的许多其他领域。其中许多可以通过荧光标记对增殖细胞进行可视化，并且适合高通量筛选。

检测复制的 DNA 可以说是检测增殖的最直接方法。这是通过使用溴脱氧尿苷 (BrdU)核苷实现的，该核苷在复制过程中融入 DNA。然后，细胞 DNA 中的这些核苷修饰可以通过抗 BrdU 抗体检测到。尽管具有特异性，但这种测定方法繁琐且难以重现，因为需要用刺激性试剂处理细胞，以使 DNA 暴露于抗体，否则这些抗体不会穿透细胞结构。

一种更温和的替代方案是乙炔基脱氧尿苷 (EdU)，可以通过将其添加到培养基中或注射到动物体内来将其递送至细胞。掺入 DNA 后，该核苷可在铜 (I) 催化下与各种荧光染料叠氮化物结合，从而对复制的 DNA 进行荧光染色。该测定易于执行、快速且可重复。它不需要对细胞进行严酷的处理（只需要用 Triton 进行透化），因此可以更好地保存细胞结构。在用叠氮化染料处理和最后的洗涤步骤（步骤 8）后，可以使用具有各种发射波长的荧光团（例如 Hoechst、DAPI或荧光标记抗体）来标记细胞。

所需试剂

• 5-乙炔基-2'-脱氧尿苷 (EdU)

• 铜 (II)-BTTAA 络合物— сlick сhemistry 催化剂

• 抗坏血酸— 铜的还原剂

• 叠氮化物荧光染料

• DMSO，标签级— 叠氮化物溶剂

• Triton X-100（或 Tween-20）

• PBS，pH 7.4

• 100 mM Tris 缓冲液，pH 7.4

协议

确切的方案取决于特定的细胞或组织类型，但一般工作流程如下所述：

1. 将细胞/组织与 10–20 μM EdU 孵育所需的时间。

2. 用含 3.7% 甲醛的 PBS 固定细胞 15 分钟。

3. 用 PBS 清洗细胞。

4. 用含有 0.2% Triton X-100（或 0.5% Tween-20）的 PBS 透化细胞 30 分钟。

5. 再次用 PBS 清洗细胞。

6. 在 100 mM Tris 缓冲液，pH 7.4（对于磺化叠氮化物）或 100 mM Tris 缓冲液，pH 7.4（含 50% DMSO）中制备含有 2 mM 铜 (II)-BTTAA 复合物、10 mM 抗坏血酸和 5 μM 叠氮化染料的混合物（对于非磺化叠氮化物）。该混合物应新鲜制备，因为铜 (I) 在水溶液中不稳定。

7. 将细胞与点击反应混合物一起孵育 30 分钟。

8. 用 PBS 清洗细胞。

9. （可选）如果细胞必须用不同的荧光团标记，请使用标准方案继续染色。

磺化（水溶性）叠氮化物，例如磺基氰叠氮化物和 AF 叠氮化物，可产生最佳效果。当使用非磺化叠氮化物（例如氰叠氮化物或 BDP 叠氮化物）时，确保反应混合物中 DMSO 浓度为 50%。

点击化学的应用——测定细胞增殖和 DNA 复制

细胞增殖测定广泛应用于细胞毒性研究、癌症研究和细胞生物学的许多其他领域。其中许多可以通过荧光标记对增殖细胞进行可视化，并且适合高通量筛选。

检测复制的 DNA 可以说是检测增殖的最直接方法。这是通过使用溴脱氧尿苷 (BrdU)核苷实现的，该核苷在复制过程中融入 DNA。然后，细胞 DNA 中的这些核苷修饰可以通过抗 BrdU 抗体检测到。尽管具有特异性，但这种测定方法繁琐且难以重现，因为需要用刺激性试剂处理细胞，以使 DNA 暴露于抗体，否则这些抗体不会穿透细胞结构。

一种更温和的替代方案是乙炔基脱氧尿苷 (EdU)，可以通过将其添加到培养基中或注射到动物体内来将其递送至细胞。掺入 DNA 后，该核苷可在铜 (I) 催化下与各种荧光染料叠氮化物结合，从而对复制的 DNA 进行荧光染色。该测定易于执行、快速且可重复。它不需要对细胞进行严酷的处理（只需要用 Triton 进行透化），因此可以更好地保存细胞结构。在用叠氮化染料处理和最后的洗涤步骤（步骤 8）后，可以使用具有各种发射波长的荧光团（例如 Hoechst、DAPI 或荧光标记抗体）来标记细胞。

所需试剂

1. 5-乙炔基-2'-脱氧尿苷 (EdU)

2. Cu-TBTA 络合物— сlick сhemistry 催化剂

3. 抗坏血酸— 铜的还原剂

4. 叠氮化物荧光染料

5. DMSO，标签级— 叠氮化物溶剂

6. Triton X-100（或 Tween-20）

7. PBS，pH 7.4

8. 100 mM Tris 缓冲液，pH 7.4

确切的方案取决于特定的细胞或组织类型，但一般工作流程如下所述：

1. 将细胞/组织与 10–20 μM EdU 孵育所需的时间。

2. 用含 3.7% 甲醛的 PBS 固定细胞 15 分钟。

3. 用 PBS 清洗细胞。

4. 用含有 0.2% Triton X-100（或 0.5% Tween-20）的 PBS 透化细胞 30 分钟。

5. 再次用 PBS 清洗细胞。

6. 在 100 mM Tris 缓冲液，pH 7.4（对于磺化叠氮化物）或 100 mM Tris 缓冲液，pH 7.4，含有 50% DMSO（对于非-磺化叠氮化物）。该混合物应新鲜制备，因为铜 (I) 在水溶液中不稳定。

7. 将细胞与点击反应混合物一起孵育 30 分钟。

8. 用 PBS 清洗细胞。

9. （可选）如果细胞必须用不同的荧光团标记，请使用标准方案继续染色。

磺化（水溶性）叠氮化物，例如磺基氰叠氮化物和 AF 叠氮化物，可产生最佳效果。当使用非磺化叠氮化物（例如氰叠氮化物或 BDP 叠氮化物）时，确保反应混合物中 DMSO 浓度为 50%。

DNA 标记方案——点击寡核苷酸和 DNA 的化学标记

点击化学是一种多功能反应，可用于合成各种缀合物。事实上，任何生物分子都可以使用点击化学方法轻松地用小分子标记，例如荧光染料、生物素等。

点击化学反应发生在两种组分之间： 叠氮化物和炔烃（末端乙炔）。叠氮基和炔基在天然生物分子中几乎从未遇到过。因此，该反应具有高度生物正交性和特异性。如果需要标记寡 核苷酸，可以在许多定制寡核苷酸合成设施和公司订购炔烃修饰的寡核苷酸。

1. 使用下表计算点击化学标记所需的试剂体积。准备所需的储备溶液（见附录）。

   试剂	混合物中的最终浓度	原液浓度
   炔烃修饰寡核苷酸	变化（20 — 200 uM）	各不相同
   叠氮化物	1.5 x（寡核苷酸浓度）	10 mM DMSO 溶液
   二甲基亚砜	50体积％	—
   抗坏血酸	0.5毫米	5 mM 水中
   铜-TBTA络合物	0.5毫米	10 mM，溶于 55 vol% DMSO

2. 将炔烃修饰的寡核苷酸或 DNA溶解在耐压小瓶中的水中。

3. 添加2M 醋酸三乙铵缓冲液（pH 7.0）至终浓度 0.2 M。

4. 添加DMSO，并涡旋。

5. 添加叠氮化物储备溶液（DMSO 中的 10 mM），并涡旋。

6. 将所需体积的 5mM 抗坏血酸储备溶液添加到混合物中，并短暂涡旋。

7. 通过向其中鼓泡惰性气体 30 秒来对溶液进行脱气。可以使用氮气、氩气或氦气。

8. 将所需量的 10 mM 铜 (II)-TBTA 库存在 55% DMSO 中添加到混合物中。用惰性气体冲洗小瓶并盖上盖子。

9. 涡旋混合物。如果观察到明显的叠氮化物沉淀，则将小瓶在 80°C 下加热 3 分钟，然后涡旋。

10. 在室温下保存过夜。

11. 用丙酮（对于寡核苷酸）或乙醇（对于 DNA）沉淀结合物。

    沉淀寡核苷酸缀合物：

    向混合物中添加至少 4 倍过量体积的 3% 高氯酸锂丙酮溶液（如果混合物体积很大，则分成几个小瓶）。

    沉淀 DNA 缀合物：

    向混合物中添加乙酸钠至终浓度0.3M；

    添加 2.5 体积的乙醇（或 0.8 体积的异丙醇）。

    充分混合并在-20°C下保持20分钟。

12. 10000 rpm 离心 10 分钟。

13. 丢弃上清液。

14. 用丙酮 (1 mL) 洗涤沉淀，以 10000 rpm 离心 10 分钟。

15. 弃去上清液，干燥沉淀，并通过 RP-HPLC 或 PAGE 纯化缀合物。