使用点击化学测定细胞增殖和 DNA 复制

细胞增殖测定广泛应用于细胞毒性研究、癌症研究和细胞生物学的许多其他领域。其中许多可以通过荧光标记对增殖细胞进行可视化，并且适合高通量筛选。

检测复制的 DNA 可以说是检测增殖的最直接方法。这是通过使用溴脱氧尿苷 (BrdU)核苷实现的，该核苷在复制过程中融入 DNA。然后，细胞 DNA 中的这些核苷修饰可以通过抗 BrdU 抗体检测到。尽管具有特异性，但这种测定方法繁琐且难以重现，因为需要用刺激性试剂处理细胞，以使 DNA 暴露于抗体，否则这些抗体不会穿透细胞结构。

一种更温和的替代方案是乙炔基脱氧尿苷 (EdU)，可以通过将其添加到培养基中或注射到动物体内来将其递送至细胞。掺入 DNA 后，该核苷可在铜 (I) 催化下与各种荧光染料叠氮化物结合，从而对复制的 DNA 进行荧光染色。该测定易于执行、快速且可重复。它不需要对细胞进行严酷的处理（只需要用 Triton 进行透化），因此可以更好地保存细胞结构。在用叠氮化染料处理和最后的洗涤步骤（步骤 8）后，可以使用具有各种发射波长的荧光团（例如 Hoechst、DAPI或荧光标记抗体）来标记细胞。

所需试剂

• 5-乙炔基-2'-脱氧尿苷 (EdU)

• 铜 (II)-BTTAA 络合物— сlick сhemistry 催化剂

• 抗坏血酸— 铜的还原剂

• 叠氮化物荧光染料

• DMSO，标签级— 叠氮化物溶剂

• Triton X-100（或 Tween-20）

• PBS，pH 7.4

• 100 mM Tris 缓冲液，pH 7.4

协议

确切的方案取决于特定的细胞或组织类型，但一般工作流程如下所述：

1. 将细胞/组织与 10–20 μM EdU 孵育所需的时间。

2. 用含 3.7% 甲醛的 PBS 固定细胞 15 分钟。

3. 用 PBS 清洗细胞。

4. 用含有 0.2% Triton X-100（或 0.5% Tween-20）的 PBS 透化细胞 30 分钟。

5. 再次用 PBS 清洗细胞。

6. 在 100 mM Tris 缓冲液，pH 7.4（对于磺化叠氮化物）或 100 mM Tris 缓冲液，pH 7.4（含 50% DMSO）中制备含有 2 mM 铜 (II)-BTTAA 复合物、10 mM 抗坏血酸和 5 μM 叠氮化染料的混合物（对于非磺化叠氮化物）。该混合物应新鲜制备，因为铜 (I) 在水溶液中不稳定。

7. 将细胞与点击反应混合物一起孵育 30 分钟。

8. 用 PBS 清洗细胞。

9. （可选）如果细胞必须用不同的荧光团标记，请使用标准方案继续染色。

磺化（水溶性）叠氮化物，例如磺基氰叠氮化物和 AF 叠氮化物，可产生最佳效果。当使用非磺化叠氮化物（例如氰叠氮化物或 BDP 叠氮化物）时，确保反应混合物中 DMSO 浓度为 50%。

微波提取 DNA 的方法和技术介绍

微波爆裂细胞是一种有用的 DNA 提取方法，特别是对于廉价、快速和高通量的工作流程？它可以用作主要的细胞裂解过程，生产用于 PCR 的粗 DNA 提取物，或作为更复杂的提取过程中的一个步骤，以改善细胞裂解。

作为一种细胞裂解方法，微波具有快速、廉价、高通量、单管的优点，并且能够在不使用任何可能影响下游过程的化学物质的情况下破裂细胞。它主要通过将样品加热到高温来工作，但也有报道在较低温度下修改细胞膜等机制（例如细菌细胞膜穿孔）。

Goodwin & Lee (1993)发表了一个早期的例子，作者在 CTAB/氯仿提取之前对不同生命领域的多种类群进行了测试。

从那时起，研究人员定期针对特定应用发布该方法的变体或实例，通常省略 CTAB/氯仿步骤并使用直接 PCR。以下是一些示例：

⭐人体样本：Taglia 等人。 (2022) 描述了使用微波 DNA 提取法提取人类样本（唾液、血液、精液）的方法。

⭐植物样本：von Post 等人。 (2003) 描述了从大麦种子中高通量提取 DNA 进行基因分型，在碱性缓冲液中使用微波，然后用 Tris-HCl 缓冲液中和，每天可以处理数千颗种子。

⭐真菌样本：Ferreira 等人。 (1996) 在 PCR 之前使用微波打开干燥的真菌孢子。

⭐动物样本：Firmansya 等人。 (2023) 比较了三种蚊子 DNA 提取方法，发现微波可以产生与其他方法相当的结果，同时是一种更快、更便宜的工作流程。

快速提取超高分子量植物 DNA 的方法和技术

对于任何有兴趣提取高分子量植物基因组 DNA 的人，例如使用牛津纳米孔或 PacBio 测序等长读长技术进行基因组测序，这里有一种快速（与类似方法相比）、简单且经济的方法，适合单-分子测序，由Li 等人描述。 （2020）。

我们发现它特别有趣，因为提取涉及细胞壁、质体 DNA 和核膜的仔细、多步骤去除，每个步骤后都有洗涤阶段，而不是单个 DNA 提取步骤然后进行清洁。

提取首先使用渗透缓冲液去除细胞壁以释放完整的细胞核。然后对细胞核进行过滤、洗涤和离心，然后在 CTAB/氯仿提取过程中轻轻裂解。叶绿体和质体 DNA 在这些过程中被去除。多个洗涤步骤有助于去除不需要的化合物，例如次生代谢物和叶绿素，而温和的裂解和缓冲液可最大限度地减少 DNA 碎片。

重要的是，该方法使用含有 Tris-HCl、蔗糖、三氯化亚精胺和四氯化精胺的新型提取缓冲液。精胺和亚精胺是多胺，可稳定和保护真核细胞中的 DNA，吸收自由基并浓缩 DNA，从而以最小的碎片提取 DNA。

另一个关键步骤是选择新鲜的嫩叶，在提取前将其在黑暗中保存长达 48 小时，以尽量减少光合副产物的积累。

在棉花、黑草和草莓中使用这种方法，作者能够在每 10 克新鲜组织中提取 100 微克 gDNA，其中大多数提取的 DNA 大小在 100 kb 到 1000 kb 之间！

DNA纯化方法和流程概述？

BiteSizeBio列出了“清理 DNA 样本的 5 种方法”。在某种程度上，这个总结是过时的并且具有误导性。让我们来看看它们是如何工作的。

1. 苯酚-氯仿萃取以去除蛋白质。将 DNA 溶液与苯酚和氯仿混合。水溶性 DNA 分配到水相中，而蛋白质在有机溶剂存在下变性，从而留在有机相中。

2. 乙醇沉淀脱盐。在 DNA 提取中，盐通过破坏将核酸固定在一起的蛋白质链来释放 DNA 链。由于 DNA 不溶于乙醇。在乙醇溶液中，盐使 DNA 不易溶于水，同时有助于保持蛋白质（有机小分子）溶解在水中。结果是，DNA 分子聚集并从溶液中沉淀出来。

3. 基于硅胶柱，使用硅胶或硅胶珠和离液盐。离液盐会破坏链之间的氢键，促进 DNA 与二氧化硅的结合以及与样品其余部分的分离。

4. 阴离子交换使用带正电荷的 DEAE 功能化树脂结合带负电荷的 DNA 磷酸主链。

5. 磁珠使用磁珠以 pH 依赖性方式有条件地结合 DNA，让您只需控制 pH 即可将 DNA 与样品的其余部分分离。磁珠带正电，在低 pH 条件下结合 DNA，但在高 pH 条件下，它们带负电荷，从而释放 DNA。

前两个实际上是称为有机提取的DNA 提取方法的一部分，该方法包括裂解步骤、苯酚氯仿提取、乙醇沉淀和洗涤步骤。

后 3 个用于 DNA 清理。所有步骤都包括结合、洗涤和洗脱步骤。其中基于磁珠的方法，因为不需要离心和其他耗时的处理步骤。它是高通量处理自动化的理想选择。由于它是现在的主流方法，珠子的成本在过去十年中下降了一半。

如何净化DNA？

图 3. DNA 纯化工作流程。

1. 混合：将纳米颗粒与 DNA 样品混合。

2. 结合：当与样品混合时，纳米粒子与目标 DNA 样品结合。

3. 清洗：使用磁力（例如磁力分离架）来拉动和聚集结合的材料。通过抽吸去除未结合的材料，剩下的是纳米颗粒结合的目标。

4. 洗脱：从纳米颗粒中释放结合的目标样品。清洁后的 DNA 样品即可用于下游应用。

如何提取游离DNA？

cfDNA 的分离、定量和评估并不是一项简单的任务。它需要敏感且可靠的工作流程。

cfDNA 是一种极其难以处理的样品类型，因为 cfDNA 的产量通常有限且高度碎片化。这就是 MagVigen™ cfDNA 提取试剂盒（货号 #K61003）发挥作用的地方。它可以为 NGS 检测提供更高产量和更高质量的 cfDNA 样本（相对于 Qiagen 试剂盒）。

cfDNA 提取工作流程

1. 1.溶解：溶解等离子体样品。

2. 2.结合和捕获：将 MagVigen™ 纳米颗粒与样品混合。纳米颗粒与 cfDNA 片段结合。

3. 3.沉淀和重新分散 1：磁性沉淀珠子直至溶液澄清。珠子响应磁力（通过使用磁铁，例如磁力分离架），使结合的材料能够快速有效地与样品的其余部分分离。通过抽吸除去上清液（未结合的材料），剩下的是纳米颗粒结合的目标。然后将珠粒重新分散在洗涤 1 缓冲液中。

4. 4.转移：将洗涤 1 溶液转移至 1.5 或 2ml 管中。

5. 5.沉淀和重新分散 2：磁力沉淀，按照步骤 3 去除上清液。这次将珠粒重新分散在 75% 乙醇中。

6. 6.清洗和沉淀 2,3：使用 75% 乙醇清洗珠粒。将珠子沉淀并除去所有上清液。将珠粒重新分散在 75% 乙醇中。执行此步骤两次。

7. 7.洗脱：高质量 cfDNA 的最终洗脱。为下游 NGS、PCR 或其他应用做好准备。
   2次洗脱有助于提高cfDNA产量。