小分子药物聚乙二醇化方法

聚乙二醇(PEG)是乙二醇的聚合物，相对分子质量为200～8000或以上。由重复的乙氧基组成，不仅具有良好的水溶性，而且易溶于苯、乙腈、乙醇等有机溶剂。 PEG分子的特点如下：

①低分散性：相对分子质量（Mr）小于5000的分散性为1.01，分子量（Mr）大于5000的分散性为1.1，具有较宽的范围。分布和更大的选择性；
②两亲性：既溶于有机溶剂又溶于水；
③无毒：研究表明大于1000的聚乙二醇无毒，已用于各种食品、化妆品和药品中；
④ 可生物降解：聚乙二醇在体内直接消除，结构不发生任何变化。分子量小于20000的代谢物可以通过肾脏代谢，较大分子可以通过消化系统代谢。

聚乙二醇化药物的特点

大多数蛋白质药物、多肽药物、化学药物都伴有一些自身无法克服的问题，如作用时间短、免疫原性大、副作用大等。 PEG呈中性、无毒，具有很好的理化性质和良好的生物相容性，是美国FDA批准用于体内注射药物的少数化学品之一。因此，通过化学方法将活化的聚乙二醇与蛋白质、肽、小分子药物和脂质体连接，即对药物分子进行聚乙二醇化，可以有效提高药物分子的生物半衰期，降低其毒副作用。可以减少影响。其中，研究最多的是蛋白质的PEG修饰。与未修饰的蛋白质药物相比，聚乙二醇化的蛋白质药物具有以下优点：

（1）生物活性更强；
（2）脂质体对肿瘤有更强的被动靶向作用；
(3)较长的半衰期；
(4)降低最大血药浓度；
(5)血药浓度轻微波动；
(6)酶促降解少；
(7)免疫原性和抗原性较低；
(8)毒性较小；
(9) 溶解性更好；
(10)减少用药次数；
(11)提高患者依从性，改善生活质量，降低治疗费用。

聚乙二醇化方法

鉴于聚乙二醇化对药物性质的巨大影响，聚乙二醇化已成为药物开发和提高已上市药物疗效的重要途径。因此，如何进行PEG化就成为重中之重。

首先，需要选择合适的PEG进行分子修饰。修饰剂的选择主要考虑以下5个方面：

（1）选择PEG相对分子质量（Mr）的确定应同时考虑生物活性和药代动力学因素。应用太大的聚乙二醇化蛋白药物会导致药物失去大部分生物活性。当使用低Mr（<20000）聚乙二醇化蛋白质药物时，修饰后的蛋白质药物与原型药物相比，生物活性和药代动力学性质没有本质变化。因此，一般选择40000-60000范围内的PEG作为修饰。
(2)修饰位点的选择应基于对蛋白质构效关系的分析。选择不与受体结合的蛋白质表面残基作为修饰位点，使得修饰后的蛋白质能够保留较高的生物活性。常见的修饰位点有氨基修饰、羧基修饰和硫醇修饰；
(3) PEG修饰剂与氨基酸反应的特异性取决于修饰剂的化学性质和修饰位点的选择。
(4)PEG修饰剂的水解稳定性和反应活性取决于活化基团的稳定性和修饰反应条件尤其是pH值的控制。一般来说，PEG修饰剂反应活性高，因此稳定性较差，容易水解；
(5)聚乙二醇化蛋白的活性、毒性和抗原性与聚乙二醇修饰的大小和类型有关。一般情况下，随着PEG相对分子量的增加，蛋白质活性的损失逐渐增加。此外，不同的PEG修饰剂对蛋白质生物活性的影响也不同。

其次，激活PEG。聚乙二醇化蛋白质主要是通过PEG末端羟基与蛋白质氨基酸残基反应实现的。 PEG末端羟基活性较差，必须用活化剂活化才能在体内温和条件下共价修饰蛋白质。常见的PEG活化方法有：

(1)羰基二咪唑法：该方法首先用于多肽的合成，并已被证明是形成酰胺键的良好试剂。

(2)N-羟基琥珀酰亚胺法： (a)活化N，N-琥珀酰亚胺碳酸酯。该反应需要在无水条件下进行。 (B) 活化琥珀酸酐和N-羟基琥珀酰亚胺。该方法得到的聚乙二醇具有较高的活性。最好在非水环境中进行蛋白质偶联。

N,N-琥珀酰亚胺碳酸酯活化的 PEG


琥珀酸酐和 N-羟基琥珀酰亚胺活化的 PEG

(3)氰尿酰氯法：氰尿酰氯又称三氯嗪(TST)，是一种对称杂环化合物。 David 使用 TST 与聚乙二醇上的羟基发生反应。只有一个氯原子被取代，其他氯原子与蛋白质氨基反应。

(4)光气活化法：Kurfuerst提到了由N-羟基琥珀酰亚胺钾盐、硝基苯酚、三氯苯酚与光气反应制备活化聚乙二醇的方法。激活分为两个步骤，如下图所示。

(5)聚乙二醇对蛋白质半胱氨酸残基进行化学修饰。磺基特异性修饰的常见PEG活化方法如下图所示。

(6)连接酶位点的聚乙二醇：除了传统的化学修饰方法外，还可以通过酶催化等其他方式实现修饰，以G-TGase为例。

最后选择合适的蛋白质氨基酸残基位点或小分子药物位点进行位点特异性修饰。用活化的PEG对合适的蛋白质氨基酸残基进行位点特异性修饰可以提高天然蛋白质的功效。蛋白质药物PEG修饰技术最大的问题是无法实现位点特异性修饰，修饰产物不均一，给分离纯化带来很大困难，也极大阻碍了临床应用。根据蛋白质的氨基酸性质和PEG衍生物的特点，科学家在使用PEG进行修饰时，选择不与受体结合的蛋白质表面残基作为修饰位点。这样，修饰后的蛋白质药物除了具有聚乙二醇化带来的优异性能外，还具有较高的生物活性。目前上市药物中常见的修饰位点包括氨基、羧基、磺基、二硫基、糖基以及非极性氨基酸的一些特定位置。

抗体药物制备过程中最需要注意的事项有哪些？

抗体偶联药物是通过连接体将针对特定抗原的单克隆抗体与小分子细胞药物连接而成。它既具有传统小分子化疗的强大杀伤作用，又具有抗体药物的肿瘤靶向特性。自从第一个ADC（Mylotarg）被批准用于治疗CD33阳性急性髓系白血病以来，已经开发了几种用于治疗癌症的ADC。

从选择合适的抗体到最终产品，ADC的整个开发过程是一项艰巨且富有挑战性的任务。临床药理学是药物开发最重要的工具之一。使用该工具有助于找到产品的最佳剂量，从而保持产品在患者群体中的安全性和有效性。与其他小分子或大分子通常仅测量一个部分/代谢物进行药代动力学分析不同，ADC 需要测量多个部分来表征其 PK 特性。因此，深入了解 ADC 的临床药理学对于在患者群体中选择安全有效的剂量至关重要。

ADC 药代动力学概述

药代动力学是临床药理学和现代药物开发重要的一部分。药代动力学研究的主要目的是获得吸收、分布容积、清除率、半衰期、多次给药后的蓄积、各种疾病状态以及年龄、体重和性别对药物药代动力学的影响。信息。这些药代动力学参数可用于为患者设计最佳给药方案。

应该认识到，与小分子和治疗性蛋白（抗体/融合蛋白）不同，ADC 的 PK 非常复杂，因为 ADC 由多种成分组成。不仅要考虑单克隆抗体的PK，还要考虑细胞毒性分子的PK以及结合的物理和化学性质。由于单克隆抗体的分子量占90%以上，ADC不同成分的PK受其PK影响较大。总抗体 (ADC+mAb) 的 PK 特性提供了 ADC 稳定性和完整性的最佳评估。缀合物和偶联位点在维持 ADC 的稳定性和 PK 方面也发挥着重要作用。下表列出了 FDA 批准的 ADC 的特性和 PK。

ADC的药代动力学特征

一般来说，给药后体内会涉及四个过程。这些过程是吸收、分布、分解代谢和清除。

吸收

大多数抗体通常通过静脉注射或输注的方式给予，也可以通过皮下途径给予抗体。然而，对于ADC来说，目前的给药途径是静脉注射或输注。由于对细胞毒性有效负载的反应和细胞毒性物质的局部沉积，SC 给药可能不适合 ADC。

分配

药物在体内的分布可以用分布容积来描述。由于其大小和极性，抗体和 ADC 的分布通常仅限于血管和细胞间隙。

ADC的初始分布一般局限于血管内，分布体积一般等于血容量。随后，ADC 可以分布到间隙空间。此外，ADC的分布也会受到靶抗原表达和内吞作用的影响。

ADC在同一组织中的分布和积累可产生不良（毒性）药理作用，这是由于摄入ADC后细胞毒性药物或代谢物的释放。

分解代谢

ADC体内分解或代谢过程包括体内抗体分解代谢和小分子药物代谢。 ADC 在到达肿瘤细胞之前在细胞（不可切割连接体）或循环系统（可切割连接体）中释放效应分子。未结合的抗体和抗体片段沿着抗体的代谢途径，通过酶水解产生氨基酸，并被人体重复利用。

ADC裂解或分解代谢后可能形成的游离小分子药物/带有氨基酸残基的小分子药物/连接体的小分子药物代谢物将进一步经过肝脏CYP450酶代谢，潜在的药物也可能发生相互作用。

除了ADC本身的性质外，抗原表达、受体/细胞密度、FcRn介导的循环、Fcγ相互作用、受体介导的内吞作用、免疫原性等都会影响ADC的分解代谢。

清除

ADC也通过分解代谢和排泄被消除。 ADC通过特定途径进入溶酶体后可被降解，与靶标结合，释放出小分子药物后从体内清除；它也可以通过非特异性胞饮作用被清除，这涉及到 FcRn 的回收过程。

ADC、抗体、分子量较大的肽和氨基酸片段不能通过肾小球过滤和排泄，而是以氨基酸的形式被重新吸收和利用。游离的小分子药物、分子量较小的肽和氨基酸连接的小分子药物、分子量较小的抗体片段等可通过肾小球滤过排出体外。同时，小分子药物和代谢物也可以通过酶代谢消除或通过转运蛋白排泄到粪便中。

ADC 生物分析

ADC有多种成分，要表征这些成分的PK特性，需要几种分析方法，如下所述：

1.ELISA免疫分析测定结合物和总抗体的动力学曲线。
2.TFC-MS/MS，定量游离药物/代谢物。
3.高分辨质谱用于体内药物抗体比分析。

此外，有两种类型的 ELISA 免疫测定用于定量测量 ADC 分析物：第一种类型的分析测量总抗体，即 DAR 大于或等于零的 ADC。第二种分析方法测量药物结合抗体，定义为 DAR 大于或等于 1 的 ADC。

其他分析方法有尺寸排阻色谱法 (SEC) 和疏水相互作用色谱法 (HIC)。 SEC 是常用的液相色谱 (LC) 技术，用于确定聚集抗体的数量。该技术也可用于 ADC。尽管 HIC 是一种用于蛋白质分离、纯化和表征的传统技术，但该技术现在正用于 ADC 表征和分析。

细胞毒性有效负载

ADC细胞毒性有效负载应具有以下特征：

1.分子的有效负载应该小，缺乏免疫原性，并且可溶于水缓冲液，以便它们可以很容易地偶联。
2.细胞毒有效负载应具有适当的脂溶性。
3.有效负载的目标应位于小区内部。
4.有效负载在血液中应稳定。

目前，常用的细胞毒性药物效应分子有微管抑制剂（auristatins/maytansinoids）、DNA损伤剂（卡利刹霉素/duocarmycins/anthracyclines/吡咯并苯二氮卓二聚体）和DNA转录抑制剂（Amatoxin/Quinolinealkaloid（SN-38））。已批准上市的几款ADC药物总共使用了6种不同的小分子药物，其中3款ADC药物使用MMAE作为结合药物，2种药物使用卡利车霉素作为结合药物。 MMAF、DM1、SN-38、Dxd也被成功使用。

药物抗体比（DAR）

DAR 是指单个单克隆抗体上附着的有效负载分子的平均数量，通常在 2 至 4 个分子之间。在极少数情况下，通过使用亲水连接器有效负载（例如 Enhertus 和 Trodelvys）可以安全地实现高达 8 的 DAR。 DAR对于ADC的疗效判定非常重要，DAR可能影响药物在循环中的稳定性、PK以及ADC的毒性。

研究表明，与DAR值<6的ADC相比，DAR值高（7-14）的ADC具有更快的清除率和较低的体内疗效。 DAR 值及其对稳定性和 PK 的影响还取决于偶联位置和连接子的大小。

通常对赖氨酸或半胱氨酸进行修饰来生产ADC。赖氨酸是连接底物和抗体常用的氨基酸残基之一。赖氨酸通常存在于抗体表面，因此很容易偶联。

其他氨基酸如半胱氨酸、酪氨酸也可以修饰，利用马来酰亚胺修饰半胱氨酸合成ADC如Adcetriss、Polivys、Padcevs、Enhertus、Trodelvys和Blenreps。

链接器

Linker是ADC重要的组成部分，决定着ADC的药物释放机制、PK、治疗指标和安全性。早期的 ADC 连接体化学不稳定，例如二硫化物和腙。这些连接体在循环中不稳定，半衰期短，通常为一到两天。最新一代的连接体在体循环中更加稳定，例如肽和葡萄糖醛酸连接体。最常见的两种连接器如下：

可切割接头

裂解接头对细胞内环境敏感，通过细胞内分解代谢和解离的联合作用释放游离的效应分子和抗体，如酸裂解接头和蛋白酶裂解接头。它们通常在血液中稳定，但会在低 pH 值和富含蛋白酶的溶酶体环境中快速裂解，释放效应分子。此外，如果效应分子可以跨膜，则可以通过发挥潜在的旁观者效应来消除肿瘤。

不可切割的接头

不可切割连接子是新一代连接子。与可裂解接头相比，它具有更好的血浆稳定性。由于不可切割接头可以比可切割接头提供更高的稳定性和耐受性，因此这些接头可以减少脱靶毒性，并提供更大的治疗窗口。

免疫原性

在针对8种ADC的11项临床试验中，ADA的基线发生率在1.4%至8.1%之间，基线后ADA的发生率在0-35.8%之间。这些值在治疗性单克隆抗体的范围内。一般来说，血液肿瘤患者中 ADC 的 ADA 发生率低于实体瘤患者；大多数 ADA 都是针对 ADC 的单克隆抗体结构域。此外，在大多数患者中，这些 ADC 的半抗原样结构不会比治疗性单克隆抗体带来更大的免疫反应风险。

ADC药代动力学模型

应用模型方法可以整合PK、疗效和安全性数据，满足ADC药物研发不同阶段的需求，如：靶点选择、抗体亲和力、接头稳定性、动物对人的外推、剂量选择和调整、ER由于ADC具有多种清除途径（解离和分解代谢）以及多种分析物复杂的PK特性，其动力学模型也较为复杂。

不同的型号有不同的应用。例如，二室模型和PBPK模型可以用来描述ADC的稳定性特征，参数包括清除率、解离率和代谢率等。目前ADC药代动力学研究主要采用非房室模型、群体药代动力学模型、基于机制的模型、基于生理的模型等。

概括

在ADC药物的研发过程中，临床药理学起着非常重要的作用。通过生物分析技术的不断发展，全面地阐明ADC药物的PK/PD特性，对于推动更多低毒、高效的ADC药物的研发具有重要意义。重要的。 ADC药物也将在肿瘤治疗领域展现出更强大的优势。

单克隆抗体-药物稳定性优化

单克隆抗体药物是生物制药的一个重要分支，因其高靶向性和特异性而受到广泛关注。随着单克隆抗体技术的不断发展，抗体药物在疾病的预防、诊断和治疗中发挥着举足轻重的作用。

抗体药物作为合成蛋白的天然特性，在生产、储存和体内使用过程中容易受到体外和体内复杂环境的物理和化学影响。并发生多种理化性质的变化，导致免疫原性增加、半衰期缩短，甚至失效。

因此，如何提高抗体药物的稳定性、降低免疫原性、延长半衰期、提高其体内生物利用度是抗体药物应用中急需解决的关键问题。

1.抗体分子结构及稳定性研究意义

抗体是指机体产生的、能与抗原特异性结合的免疫球蛋白。抗体由 B 淋巴细胞转化的浆细胞分泌和产生。每个B淋巴细胞系只能产生一种针对特定抗原决定簇的特异性抗体。这种由单一细胞系产生的抗体称为单克隆抗体（mAb）。

常规单克隆抗体分子由两条重链（HC）和两条轻链（LC）通过链间二硫键连接形成“Y”形结构，可分为三个功能部分：两个抗原结合片段(Fab) 和晶体区域 (Fc)。两个Fab通过铰链区与Fc连接，构象变化比Fc更加灵活。 Fab 的 Fv 区由重链和轻链的一对可变区（VH 和 VL）组成。通常，Fv区经过糖基化修饰，这决定了抗体如何与适应性免疫和体液免疫系统中的其他成分相互作用。

研究发现，某些单克隆抗体药物虽然在体外实验中表现出良好的药物活性，但进入临床试验阶段时会遇到体内活性降低的问题。因此，在药物研发初期必须考虑药效学问题。

目前提高蛋白质热稳定性的方法主要有非共价修饰、化学修饰、添加蛋白质稳定剂、蛋白质工程等。在液态时，通过矿化技术直接在蛋白质表面形成磷酸钙矿化壳，提高蛋白质稳定性。

可见，在保证抗体的亲和力和表达量不受到太大影响的同时，大程度地提高其稳定性对于抗体药物的研发具有重要的现实意义。

2.抗体稳定性评估方法

生物技术产品的稳定性评估通常包括生物活性分析、分子结构和纯度分析（包括降解产物的定量检测）以及相关参数（如外观、pH值等）的监测。

结合以上数据评价样品的热稳定性、聚集性和分子间力的大小。

在热稳定性的评价和分析中，差示扫描量热法（DSC）是目前常用的测量蛋白质热稳定性的方法，该方法不仅可以获得熔化温度，还可以获得与熔化相关的焓、熵和自由能。

此外，在蛋白质溶解度预测方面，研究人员相继提出了交叉作用色谱（CIC）、亲和捕获自相互作用-纳米粒子光谱（AC-SINS）或克隆自相互作用-生物层干扰（CSI）-BLI）等技术也取得了一定的进展。

这些方法评估低蛋白质浓度下单克隆抗体交叉或自身相互作用的可能性，以预测高浓度下单克隆抗体的特性。

随着计算机辅助设计在生物大分子开发中的应用，对于晶体结构不确定的分子，可以利用大量的建模和仿真软件来预测抗体-抗原复合物的三维结构。不同的力场也可用于分子动力学 (MD) 模拟 3，以获得有关结合相互作用、稳定性的更详细信息，并更轻松地计算非共价键能（疏水、静电、非极性和结合能） 。

3.稳定性修改方案

3.1 抗体分子结构的修饰

基于抗体分子化学修饰位点的结构修饰一直是稳定性优化的重要方向。其中，抗体CDR区的脱酰胺基可能会导致抗原结合功能的丧失。

研究已逐渐阐明脱酰胺和化学修饰的机理及其作用。而且研究证实Gln的脱酰胺速率比Asn慢很多。因此，去除脱酰胺位点或通过将Asn突变为Gln来降低脱酰胺作用的概率被视为解决方案4。

3.2 生产工艺优化

研究指出，抗体在过酸或过碱条件下会以不同方式降解。在用于静脉注射的pH 6.8的免疫球蛋白（IGIV）制剂中，可以通过添加麦芽糖稳定剂来改善这种由pH引起的不稳定性。

表面活性剂通常添加到单克隆抗体药物制剂中，以减少疏水区域的暴露，或通过竞争吸附位点来减少蛋白质相互作用和界面诱导的聚集。其中，常用的非离子表面活性剂有聚山梨酯20和聚山梨酯80 7。

此外，某些氨基酸经常被用作赋形剂以防止聚集。常用的精氨酸（Arg）可以增加蛋白质的溶解度并保护它们免受光和高温引起的聚集。

改进抗体药品的储存或包装通常更经济。迄今为止，防止蛋白质与容器表面相互作用的方法是对表面进行涂层，即表面钝化。

涂层大致可分为两类：单层涂层（较常用）和多层涂层（可控性较差）。更常用的涂层聚合物包括乙二醇或环氧乙烷11。此外，使用极性或中性电荷的聚合物涂层也能够减少蛋白质吸附12。

4。结论

治疗性单克隆抗体药物是目前生物医药领域的研发热点，在此基础上，单链抗体（SCFV）、单域抗体、抗体药物偶联物（ADC）等药物应用于多种器官系统疾病相继获批上市。

如何在不改变药物靶向性、平衡效应和免疫原性的情况下提高药物的稳定性是一个至关重要的问题。并尽可能延长药物半衰期，维持有效血药浓度。抗体稳定性受环境、配方、自身结构、生产操作等多种因素影响，有效评价抗体稳定性是个体化改造的前提。

稳定性评价不应仅根据降解产物的有无或稳定分子的浓度来定义，而应包括以下三个方面：物理稳定性研究的评价应涵盖聚集体和碎片的数量以及结构；化学稳定性研究应关注蛋白质降解；生物稳定性研究应确保单克隆抗体对靶标的活性与其物理和化学稳定性一致。

深入探讨影响抗体稳定性的因素和评价方法，将有助于抗体药物的合理优化和新药的研发。

蛋白质药物中的聚乙二醇修饰试剂的使用

改性PEG也称为改性聚乙二醇，是通过化学修饰基团或生物活性基团进行修饰的PEG。在药物开发和研究中，为了增加蛋白质或肽药物在体内的半衰期，降低免疫原性，同时增加药物的水溶性，将活化的聚乙二醇与蛋白质、肽、小分子化学偶联。分子有机药物和脂质体。药物经过PEG修饰后，往往具有以下优点：

1）半衰期较长
2）最高血药浓度较低
3）血药浓度波动小
4）酶降解较少
5）免疫原性和抗原性较小
6）毒性较小
7）溶解度较好
8）减少用药频率
9）提高患者依从性，改善提高生活质量，降低治疗费用
10）脂质体对肿瘤有更强的被动靶向作用

修饰PEG的用途介绍：

1.蛋白质药物的PEG修饰

PEG修饰的蛋白质药物可以延长药物的半衰期，降低免疫原性，并最大限度地保留其生物活性。作为治疗药物，用聚乙二醇（PEG）修饰的蛋白质比未修饰的蛋白质更有效。 PEG修饰蛋白质药物主要包括氨基修饰（包括N端氨基酰化修饰、赖氨酸侧链氨基酰化修饰、N端氨基烷基化修饰）、羧基修饰、巯基修饰。
PEG还可修饰蚓激酶、SOD、胰凝乳蛋白酶、G-CSF、pal酶、蛋白A、蛋白B、蛋白半胱氨酸等。

2.肽类化合物的PEG修饰

PEG修饰的肽类化合物，如边界降钙素、表皮生长因子的PEG修饰产物，比原型药物具有明显更高的半衰期和生物活性。尤其是在聚乙二醇的位点特异性修饰方面，肽类化合物比蛋白质更容易实现。在肽化合物的PEG修饰研究中最常见的应用是mPEG。

3.PEG修饰脂质体

脂质体是目前将各种药物转运至细胞内有效的载体之一。常见的免疫脂质体在血液中的循环半衰期短，且易于消除，限制了其发展。 PEG修饰的长循环脂质体不仅可以逃避网状内皮系统的捕获， 而且可以通过增加脂质体的血液循环时间来提高脂质体的被动靶向性。已广泛应用于脂质体药物制剂中。 PEG修饰的阿霉素脂质体比原药心脏毒性小，增加了患者耐受性，在体内起到控释和靶向药物的作用。

4. PEG修饰的有机小分子药物

小分子药物很多，其中大部分是抗肿瘤药物。利用PEG修饰技术，聚乙二醇支持小分子，可以将其许多优异的性质转移到缀合物上。其中，该聚合物具有优异的生物相容性，可溶解于体内组织液中，并能快速排出体外，无任何毒副作用。许多抗肿瘤药物都是通过高分子量PEG进行修饰，以实现被动靶向药物递送至肿瘤组织。PEG修饰方法主要是将PEG与这些小分子药物上的-OH、-NH2、-COOH偶联。如果待修饰的小分子药物不具有这些官能团，可以通过化学方法引入。

5.其他应用

PEG 修饰的亲和配体和辅因子用于水性两相分配系统，用于生物大分子和细胞的纯化和分析。 PEG修饰的碳水化合物可作为新的药物材料和药物载体。寡核苷酸聚乙二醇化可以增加溶解度、增加对核酸酶的抵抗力和细胞膜渗透性。生物材料的聚乙二醇化可以减少血栓形成并减少蛋白质和细胞粘附。

药物输送系统：外泌体 & 脂质体

外泌体是广泛分布在组织中的天然纳米颗粒，可以由所有已知的细胞产生。外泌体是包裹在脂质双层膜中的纳米级细胞外囊泡，由大多数真核细胞分泌，具有的特性——固有的稳定性、低免疫原性、生物相容性和良好的生物膜穿透能力——使其能够作为高效的天然纳米载体。越来越多的研究表明，外泌体可以调节多种生物学功能，是临床诊断中生物标志物的重要来源。

1. 外泌体的介绍

外泌体是细胞内多泡体（MVB）与细胞膜融合后释放到细胞外基质中的膜性囊泡，可以运输丰富的蛋白质、脂质、DNA、RNA等物质。在自然界中，外泌体保护和传递功能性大分子，包括核酸、蛋白质、脂质和碳水化合物。外泌体通过将大分子转移到受体细胞或激活信号通路来改变受体细胞的行为。如转录与翻译、组织修复、免疫平衡、细胞分化与再生、细胞凋亡、细胞迁移、代谢调控、微生物环境等，这些远远不能涵盖近年来学术界广泛的研究工作。 

外泌体堪称“正邪兼备”的“多面手”，疾病的发生发展离不开它，免疫功能也离不开它，疾病诊断有时需要它，也可以用来制造疫苗。更多“坏”和“好”外泌体仍在被发现，更多外泌体的作用也在不断探索。最近的研究表明外泌体作为无细胞疗法的潜在用途，这可能为解决临床难题提供新策略。

越来越多的研究表明，外泌体在细胞间的长距离通讯中发挥着至关重要的作用，因为它们可以通过循环系统到达其他细胞和组织，产生远程调节。因此，人们对外泌体的功能及其作为小分子治疗载体的潜在应用产生了极大的兴趣。本文讨论了外泌体作为“天然纳米颗粒”用于递送药物和基因的潜力，并比较了其与脂质体的优缺点。

图1 通过外泌体进行细胞间通讯

2. 外泌体作为载体的优势和潜力

为了实现药物或基因递送，重要的是要考虑所使用的载体类型。外泌体载体结合了细胞药物递送和纳米技术的优点，可实现高效药物递送。与细胞疗法相比，外泌体更容易储存，可以降低安全风险。外泌体可以从患者体液或细胞培养物中分离出来，进行修饰并转移回同一患者体内。

人们对外泌体作为药物载体的期待源于外泌体的结构。其结构简单，外部是由磷脂双层组成的膜，膜内分布有丰富的蛋白质，内部是空腔，可负载大分子、小分子和核酸。空腔是我们可以用来 输送药物的空间。外部蛋白质的存在是非常有价值的。一方面，它可以提供低免疫原性和可重复给药的巨大潜力。另一方面，这些蛋白质可用于表面修饰、负载大分子和改善靶向性。

图2 外泌体结构

外泌体的医学潜力主要包括三大方向（图3）：

A.外泌体在诊断预防中的潜力：从病例微环境中提取的外泌体可用作诊断特定疾病和损伤的生物标志物。

B. 外泌体的医疗潜力：外泌体由多种细胞产生，并以多种方式与靶细胞相互作用，产生医疗作用。

C.外泌体的药物递送潜力：外泌体可用于递送多种药物，如RNA、蛋白质和小分子。
 

图3 外泌体的潜在应用

3. 外泌体的摄取和潜在靶向

外泌体起源于晚期内吞作用，可以扩散到细胞间液中。外泌体可以通过与靶细胞快速融合或受体介导的内吞作用来运输物质。到达特定受体细胞后，外泌体表面分子与膜受体结合，包括细胞间粘附分子、淋巴细胞功能相关抗原 1 和 TIM1 (TIM4)。最后，外泌体的内容物被释放到细胞质中，引起受体细胞的细胞内区室的变化。分泌的外泌体可能通过三种潜在机制被靶细胞吸收（图 4）。

A. 通过细胞膜的简单融合。

B.内吞作用。

C. 通过特定表面配体激活靶细胞。外泌体中的一些蛋白质成分可能有助于保护层和稳定囊泡结构的形成，并可能携带靶向信息。

图4 靶细胞摄取外泌体的机制
（来源：参考文献[2]）

4. 脂质体和外泌体给药的比较

将治疗剂输送到作用部位的主要挑战是脱靶毒性、快速清除以及靶组织、细胞或细胞器中的低积累和生物利用度。为了克服这些挑战，过去几十年来开发了多种合成递送载体（脂质体、脂质纳米颗粒、聚合物胶束、无机纳米颗粒、树枝状聚合物等），其中一些已获得临床批准。在所有可用的纳米颗粒图谱中，迄今为止市场上最成功且经临床批准的载体是脂质体。由于脂质体和外泌体之间的相似性，接下来将比较两者的理化性质和药物递送能力。  

A.脂质体：将脂质药物负载到双层膜中；可以掺入配体以增加组织靶向特异性；亲水性药物可以负载在脂质体的腔内。 Onpattro 是美国食品和药物管理局 (FDA) 批准的第一个装载 siRNA 的脂质纳米颗粒，由可电离脂质、胆固醇、聚乙二醇化脂质和辅助脂质组成。

B.外泌体：可以将蛋白质、亲水性药物和核酸（miRNA、siRNA、mRNA等）装载到囊泡的腔内，同时可以将靶向配体、膜蛋白和亲脂性药物掺入膜中。

图5 脂质体和外泌体

物理特性、生产和质量控制

脂质体在结构上与外泌体相似，因为它们由脂质双层组成。类似地，外泌体可以在脂膜双层内携带疏水性药物，在水性核心内携带亲水性药物。此外，临床批准的脂质体大小约为 100 nm，与外泌体类似。此外，脂质体的大小允许静脉内给药并在细胞摄取后外渗到身体的某些部位。

尽管脂质体和细胞外囊泡 (EV)有相似之处，但它们作为药物递送载体之间存在许多差异。与外泌体相比，临床使用的脂质体由有限数量的脂质组成，但不含蛋白质和遗传物质等细胞成分，因此在药物质量控制和大规模生产过程中相对容易处理。

然而，外泌体富含鞘磷脂、胆固醇和溶血磷脂，因此外泌体可以实现比在脂质体中混合单个成分更高程度的复杂性。此外，由于膜和核心中存在生物分子，外泌体中可能存在额外的结合袋用于载药。这对制造和质量控制提出了更高的要求，而迄今为止，外泌体的规模化在生产和收获方面都具挑战性。

外泌体和脂质体的体内给药

纳米颗粒（外泌体和脂质体）被单核吞噬细胞系统（MPS）快速清除。脂质体代表可生物降解和生物相容性 DDS，具有非常通用的高通量制备和药物封装效率，允许冻干和表面修饰。为了降低免疫原性并避免脂质体快速被血液清除，广泛使用聚乙二醇（PEG）表面涂层，从而允许在靶组织中积累更多物质。用 PEG 或 PEG 缀合的靶向配体修饰外泌体已被提议作为增强外泌体药物递送能力的有前途的策略。另一个有趣的策略是选择含有特定表面蛋白（例如 CD47）的外泌体子集。这种蛋白质在外泌体中充当“不要吃我”的信号，可能使它们能够绕过 MPS 并表现出更长的循环时间。

生物分布

市场上所有获批的脂质体药物均依赖于被动靶向，只有一小部分主动靶向药物已进入临床阶段。这是因为，即使当表面配体用于靶向靶细胞上的特定受体时，脂质体的积累仍然被认为是由称为增强渗透性和保留（EPR）效应的被动外渗过程决定的。通过EPR效应，循环时间较长的脂质体容易在肿瘤或受损心肌中积聚。

药代动力学和药效学（PK/PD）

PK/PD作为基于药物生理药理作用的模拟系统，可以为药物的治疗效果提供有价值的信息。与游离形式相比，药物封装在脂质体中可防止快速清除并显着改变药物的 PK 特性。由于表面 CD47 的存在，与脂质体相比，外泌体可能具有降低 MPS 介导的清除率的潜力，但还需要更多证据。由于大规模外泌体生产的挑战和内源性外泌体的存在，关于外泌体的 PK/PD 特性的信息很少。全面了解外泌体作为 DDS 的 PK/PD 特性对于外泌体进入临床至关重要。

外泌体作为载体的挑战

探索外泌体临床应用的一个关键问题是，对于获得高产量纯外泌体的最佳方法缺乏共识。这主要是由于哺乳动物细胞释放的外泌体数量相对较少。此外，外泌体的纯化很麻烦。有多种方法可从细胞培养上清液或生物液体（如牛奶、尿液、血浆、羊水、唾液和脑脊液）中分离外泌体（见表 1）。这些方法各有优点和缺点。

要获得高产率的纯外泌体，首要途径是扩大外泌体的来源。除此之外，人们还努力将细胞和纳米载体的特性结合起来。此外，能够在不破坏外泌体的情况下增强各种货物的装载能力和靶向能力也非常重要。因此，许多研究人员致力于开发合适的方法来修饰外泌体以负载药物或基因。

结论

近年来，外泌体在生物医学领域受到广泛关注，其易于负载多个分子、具有靶向性、工程化潜力、免疫原性低、适合重复给药等。外泌体作为新的研究热点，已成为疾病诊断和治疗的潜在有效方法，前景广阔。当然，外泌体有其自身的一些局限性。现阶段外泌体的研究并不丰富，因此生产率较低，这也是该领域需要改进的方向。尽管如此，使用外泌体作为药物或基因递送载体仍处于起步阶段。我们相信，随着外泌体研究的深入，外泌体疗法最终可能会导致药物或基因递送领域的重大突破。

Polyethylene glycol（PEG）因其“隐形”特性和生物相容性而被广泛应用于药物输送和纳米技术。BiopharmaPEG一直专注于纳米载体系统（包括各类纳米颗粒、脂质体、胶束等）全系列医疗应用和技术的开发，在该领域积累了大量的数据模型和丰富的研究经验。基因疫苗和蛋白药物纳米载体的构建和优化。

药物偶联物简介

药物偶联物，特别是抗体药物偶联物（ADC），因其临床效果和潜在商业价值而受到广泛关注。而技术的进步导致了药物偶联物新旧理念的交织碰撞，甚至对现有的理念和技术提出了挑战。

如今，出现了多种新的缀合技术概念，包括肽药物缀合物（PDC）、小分子药物缀合物（SMDC）、免疫刺激抗体缀合物（ISAC）、抗体-寡核苷酸缀合物（AOC）、放射性核素药物缀合物（ RDC）、抗体片段-药物偶联物（FDC）、适体药物偶联物（ApDC）、抗体细胞药物偶联物（ACC）、病毒样药物偶联物（VDC）等。此外，新的技术形式如抗体降解剂偶联物（ ADeC）仍在不断涌现。本文简要介绍了几类药物偶联物的技术特点和代表性项目开发进展。

抗体药物偶联物 (ADC)

抗体药物偶联物（ADC）是目前最成功的药物偶联物类型，上市药物数量最多，具有良好的临床效益和商业价值。根据2021年《Nature Reviews Drug Discovery》发表的文章，到2026年全球ADC药物市场将达到164亿美元

ADC 旨在通过基于抗体靶向将细胞毒性药物引入癌细胞周围来减少全身暴露并提高安全性。该药物由三个主要成分组成：抗体（靶向）-连接器（将抗体与有效负载连接）-有效负载（杀死肿瘤细胞）。

图1|抗体-药物缀合物构建体。图片来源：参考文献1

ADC药物的开发最早，但随着基于更先进技术开发的药物临床验证数据的增加，其面临的挑战也最大。首先，人们普遍认为抗体靶标应该被很好地内吞，但免疫刺激抗体偶联物 (ISAC) 表明也许不需要靶蛋白内吞。其次，传统观点认为抗原必须过度表达，而正常细胞不表达或低表达，而今年 ASCO 会议上 disitamab vedotin 的亚组分析显示，它对几乎所有 HER2 阳性和 HER2 低表达乳腺癌都有益处，以及Enhertu 也适用于 HER2 阳性和 HER2 低表达的肿瘤物种。第三，弹头的品种已经丰富，并不一定需要细胞毒性，免疫刺激剂和调节剂（STING、TLR、Treg）、蛋白水解靶向嵌合体（Protac）、寡核苷酸等药物也在临床或临床前研究中显示出初步有效性。

截至2022年12月，全球已有15种ADC药物获批上市，以及超过400种已公布的在研ADC候选药物，主要集中在肿瘤、罕见病和血液学治疗领域。有 136 种候选药物专注于共同靶标，其中 53 种针对HER2。

放射性核素抗体偶联物 (RAC)

放射性核素药物偶联物 (RDC) 与 ADC 类似，它们使用抗体或小分子（包括肽）介导的靶向来精确靶向细胞毒性/成像因子（放射性核素放射性同位素），以避免全身暴露的潜在危险。不同之处在于RDC负载是放射性核素，可用于诊断和治疗功能。其成分也与ADC略有不同，需要添加螯合毒素的特定官能团结构（螯合剂）。一般来说，它仍然由配体-连接体-有效负载组成。

图 2. 放射性核素药物结合物 图片来源：imagingprobes

诺华2017 年以 39 亿美元收购了 Advanced Accelerator applications，其 RDC 药物 Lutathera（镥（177Lu）氧曲肽）自上市以来已成功商业化。 2018 年 10 月，以 21 亿美元收购 Endatory 后，又收购了其 PSMA 靶向放射性配体疗法 177Lu-PSMA-617。

表 1. 近五年 FDA 批准的 RDC

在今年的 ASCO 会议上公布 VISION 研究结果后，177Lu-PSMA-617 被FDA授予突破性疗法称号。在转移性去势抵抗性前列腺癌的治疗中，177Lu-PSMA-617 显着改善了中位影像学无进展生存期（8.7 vs. 3.4 m）并延长了 OS，并将影像学进展或死亡风险降低了 60%。

图 3 和图 4。Lutetium-177-PSMA-617，图像来源：ASCO 2021：

小分子药物偶联物 (SMDC)

小分子药物偶联物（SMDC）通常也由靶分子、接头和效应分子（细胞毒性分子、E3连接酶等）组成。

图 5. 小分子-药物缀合物，图片来源：Network of Cancer Research

事实上，目前药物偶联物的过度细分也导致了不同概念药物之间的交叉。例如，肽药物偶联物（PDC），通常仍然属于小分子药物偶联物。 Lutathera，177Lu-PSMA-617，虽然根据毒素被归类为RDC，但其靶向配体均属于小分子领域。最近，PEPAXTO获批上市，Oncopeptides将其定位为肽-药物缀合物，但其分子结构并不是药物缀合物组合物的通常形式，或者应该属于前药缀合物（Pro-DC）或前药，在癌细胞周围分解，达到烷化剂样的肿瘤杀伤作用。

图 6. PEPAXTO 的结构

因此，我们结合了小分子药物偶联物和肽药物偶联物的分析。小分子领域，Endatory产品Vintafolide有条件上市，但临床三期研究失败后撤市。

表 2. 正在调查的 SMDC 和 PDC

免疫刺激抗体偶联物 (ISAC)

免疫刺激抗体偶联物（ISAC）的技术要求与ADC非常相似，不同之处在于ISAC负载的是先天免疫激动剂或调节剂，能够将冷肿瘤转化为免疫热肿瘤。此外，其功能与肿瘤微环境激活药物偶联物（TMAC）部分相似，均通过调节免疫刺激和微环境来实现免疫杀伤激活和治疗增敏。

图 7. 免疫刺激抗体偶联物，图片来源：AACR2021

目前参与此类机制的药物主要有Toll样受体激动剂（TLR）型ISAC药物SBT6050、SBT6290、BDC-1001。 STING激动剂ISAC药物XMT-2056、Treg细胞调节ISAC药物ADCT-301等。不过，其中很多药物也被企业自己定义为ADC药物，或许也是因为两者在术语上并没有太多区别药物的外观性能和技术。

图 8. BDC-1001，图片来源：BOLT BIOTHERAPEUTICS

抗体降解剂偶联物 (AdeC)

2021 年 6 月 16 日，瑞士公司 Debiopharm 和韩国公司 Ubix Therapeutics 联合宣布开展研究合作，结合 Multilink 和 Degraducer 两个专有技术平台开发 Antibody Degraducer Conjugates (ADeC)。

图 9. 抗体-降解剂-缀合物

这种合作才刚刚开始，或许相关药物还没有被研究出来。然而，根据他们的平台技术，预计将开发的ADeC药物将是一种抗体药物缀合物，用降解分子取代有效负载，或许还携带其他有效负载以产生协同效应。 ETC。

ADeC的目的还在于将降解的分子携带至靶位点，避免全身暴露，甚至克服Protac分子的一些潜在成药性问题，如理化缺陷、特异性、PK等。

在 AdeC 领域，Orum Therapeutics 已开始临床前研究，并于最近完成了 8400 万美元的 B 轮融资，以继续推进其产品线。

图 10. Orum 疗法

Orum Therapeutics 的技术还结合了与抗体偶联的蛋白质降解剂，其概念与 Debiopharm 和 Ubix 的技术相似，特别是降解剂，两者都具有泛素酶降解作用机制。

然而，两者也有所不同，Orum Therapeutics 将类别定义为抗体 neoDegrader 缀合物 (AnDC)。

图 11. 抗体-neoDegrader-缀合物，来源：Orum Therapeutics

抗体片段-药物偶联物 (FDC)

抗体片段-药物偶联物（FDC），顾名思义，就是用较小的抗体片段（单链scFv）来替代较大的抗体分子。人们普遍认为抗体片段相对容易找到，并且可以通过生物工程实现更高的 DAR。

图12.抗体片段-药物偶联物（FDC），来源：antikor网站

FDC在技术上与ADC几乎相同，但使用更小的片段抗体有望提高肿瘤渗透性并最大限度地提高药物疗效。小碎片和缺乏 Fc 可以在正常组织和循环中快速清除，从而降低毒性。

适体药物偶联物 (ApDC)

适体药物偶联物 (ApDC) 是药物偶联物的一种形式，它使用结构化寡核苷酸序列作为相应分子的靶标。核酸适体被称为“化学抗体”，具有与抗体类似的靶向和靶点结合特性。与抗体相比，核酸适配体还具有稳定性高、免疫原性低、生产成本低、易于化学修饰等诸多优点。

图 13. 适体药物缀合物 (ApDC)，来源：分子疗法：核酸

由于ApDC药物使用寡核苷酸序列，因此它们在接头和缀合策略方面可能与ADC药物不同，但在药物成分、作用机制和有效负载方面与ADC药物没有太大区别。

病毒样药物偶联物 (VDC)

病毒样药物结合物（VDC）是药物结合物的一种形式，它使用设计为非感染性蛋白质纳米颗粒（病毒样颗粒（VLP））的病毒衣壳作为有效的递送载体。

图 14. 病毒样药物偶联物 (VDC)，来源：Aura 网站

Aura采用人乳头瘤病毒（HPV）衍生的VLP选择性附着在修饰的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（HSPG）表面，以实现与实体瘤细胞或转移瘤的结合，但不与正常组织结合。AU-001是该机制的VDC产物。病毒样成分选择性地与HSPG结合，结合的红外光激活细胞被激活，选择性地破坏肿瘤细胞，导致肿瘤细胞急性坏死，同时激活免疫系统产生抗肿瘤反应。

图 14.  AU-011，来源：  Aura 网站

抗体-寡核苷酸缀合物 (AOC)

抗体-寡核苷酸缀合物 (AOC) 是治疗性寡核苷酸利用抗体将siRNA（siRNA、PMO等）递送至特定细胞或组织，从而减少治疗患者疾病所需的药物量，并解决不可靶向和寡核苷酸递送的问题。寡核苷酸与靶向配体的缀合还可以改善寡核苷酸（治疗性RNA或DNA分子）的药代动力学特性并扩大其应用。与ApDC不同的是，AOC旨在实现寡核苷酸的靶向递送，阿斯利康已经对相关产品进行了研究。从技术上来说，AOC使用抗体作为传递介质，也可以假设小分子（包括肽）、蛋白质（酶）等也可以发挥相关功能。细分时，仅以寡核苷酸作为有效负载的药物也产生了各种概念产品。

图 15. 抗体-寡核苷酸缀合物 (AOC)，来源：avidity biosciences 网站

Avidity还基于此理念开发了AOC产品AOC1001，用于治疗强直性肌营养不良1型（DM1）疾病，并计划于2021年下半年进行相关临床研究。

结论

总而言之，现阶段的药物缀合物仍然保留相同的组成，即“配体-连接子-效应物”形式。由于技术的进步和药物剂型的繁荣，配体、连接臂和效应分子的定位有了更多的选择，导致了该领域的细分，并出现了多种药物缀合物的表达方式，如ADC、RDC、SMDC、 ISAC、ADeC、PDC、FDC、VDC、AOC 等。但过度的细分也造成了产品概念的混乱，即使是同一产品，不同企业的定义也存在差异。

本质上，大多数药物缀合物都是通过定位配体来达到靶向目的，以及不同功能的效应分子来达到治疗价值或临床目的；产品设计理念延续了ADC药物思路，不同的是三类成分（配体-连接体-效应分子）的转化。不过，ADC、RDC、SMDC和ISAC仍然是最成功的药物偶联物类型，并且已经有相关药物上市或多个临床药物处于概念验证阶段，而其他药物偶联物仍更多处于概念或阶段目前尚处于临床前阶段，能否实现临床价值还有待观察。

可生物降解药物递送肽纳米胶囊

长期以来，纳米粒子的研究总是需要某种程度的权衡。纳米载体可能有效转染，但对细胞有毒。其他人可能不会引起免疫反应，但由于缺乏生物降解性，会随着时间的推移在环境中积聚。BAPC 不仅克服了现有纳米载体的所有问题，而且提供了一定程度的定制，使它们成为几乎任何应用的选择。

支链两亲肽胶囊 （BAPC） 是一种高效的运输系统，可以输送核酸、小蛋白和溶质。BAPC的分解能力对于它们作为人类和农业应用的运载工具的采用至关重要。然而，到目前为止，BAPCs被证明对哺乳动物的降解系统是惰性的。在这里，我们使用BAPCs封装有毒尿素类似物硫脲，证明常见的土壤真菌构巢曲霉可以降解BAPC。我们提供的证据表明，这种降解是通过分泌蛋白酶的作用进行的细胞外降解。我们的数据表明，BAPCs很可能在环境中可生物降解。

新的纳米载体技术有望在通过粘膜输送治疗药物方面取得突破

Phoreus Biotech 是下一代肽纳米载体的优质供应商，今天宣布其专有纳米载体技术组合新增一项。 两亲性肽胶囊 (APC) 提供了一种将核酸和治疗剂封装在水溶液中以改善通过粘膜的递送的新方法。 

囊性纤维化 (CF) 是一种遗传性疾病，影响着数以万计的儿童和年轻人，几乎总是会导致严重的健康并发症和寿命大幅缩短。药物治疗的最新进展在解决这种情况方面取得了重大进展 – 然而，将药物成功递送至靶细胞仍然是一个主要挑战。 APC 很可能是更有效地将 CF 疗法输送到肺部的关键。

在与堪萨斯大学医学院进行的研究中，APC 已被证明可以成功到达并穿透囊性纤维化肺组织模型中的顶端表面细胞。由于它们的高表面电荷，APC 可以轻松地穿过患病肺组织产生的多余粘液，这在过去已被证明是 CF 治疗的一个困难障碍。

“这种载体具有作为肺部化合物顶端递送以治疗气道疾病的输送系统的潜力，”堪萨斯大学医学中心研究助理教授，肺，重症监护和睡眠医学的Michael Kim博士说。“我们的实验室目前正在评估APC平台将小分子递送到囊性纤维化人气道上皮细胞中的有效性。

APC在递送过程中为mRNA提供保护，然后最终在细胞内部打开以释放其治疗货物。虽然最初的研究集中在CF上，但这种递送方法有望治疗各种呼吸系统疾病，以及输送穿透口腔，眼部和鼻膜所需的药物。 

APC还具有不被人体免疫系统识别的优点，允许它们用于治疗而不会引发负面的免疫系统反应。还计划进行研究，探索它们在癌症、遗传疾病和其他可用核酸疗法治疗的疾病中的应用。