Amplite 比色法L-乳酸检测试剂盒是美国AAT Bioquest生产的用于检测乳酸的试剂盒，乳酸是手性的并且具有两种光学异构体：L-乳酸和D-乳酸。在代谢和运动过程中，乳酸盐通过乳酸脱氢酶（LDH）不断从丙酮酸产生。 监测乳酸水平是评估组织需氧量和利用率之间平衡的好方法，在研究细胞和动物生理学时非常有用。D-乳酸不被哺乳动物代谢，其从体内主要取决于肾脏排泄。D-和L-乳酸存在于许多发酵乳制品中，例如酸奶和奶酪，以及腌制蔬菜，腌制肉类和鱼类。D-和L-乳酸含量是食品的质量指标，如鸡蛋，牛奶，果汁和葡萄酒。血液中异常高浓度的D-乳酸通常是胃肠道中过度生长的反映。

AAT Bioquest的Amplite 乳酸盐检测试剂盒（L＃乳酸检测Cat＃13814和13815，D-lactate检测Cat＃13810和13811）提供荧光和吸光度检测方法，用于检测L-乳酸盐或D-乳酸盐。生物样品，如血清，血浆，尿液，以及细胞培养样品。在酶偶联测定中，乳酸与NADH成比例相关，其通过生色NADH传感器特异性监测。通过吸光度酶标仪在~575nm或~55075nm / A605nm的吸光度比下可以容易地读取信号，以提高测定灵敏度。使用此Colorimetric Amplite L-乳酸测定试剂盒，我们能够在100μL反应体积中检测到低至4μM的L-乳酸。它应用广泛，可以很容易地适用于需要测量L-乳酸的各种应用。金畔生物是AAT Bioquest的中国代理商，为您提供优质的Amplite 比色法L-乳酸检测试剂盒。

适用仪器

96孔板测定示例

概述

制备L-乳酸测定混合物（50μL）

加入L-乳酸标准品或测试样品（50μL）

在室温下孵育30分钟~2小时

监测吸光度比率在A575nm / A605nm处增加

注意：在开始实验之前，在室温下解冻每个试剂盒组分中的一个。

操作方法

1.准备NAD储备溶液（100X）：

向NAD小瓶（组分C）中加入100μLH2O，制成100×NAD储备溶液。

2.准备L-乳酸盐储备液：

将200μLH2 O或1×PBS缓冲液加入L-乳酸盐标准品（组分D）的小瓶中以制备100mM D-乳酸盐标准溶液。

注意：未使用的L-lacate标准储备溶液应分成单次使用的等分试样并储存在-20℃。

3.准备L-乳酸标准品（0至1 mM）的连续稀释液：

3.1将10μLL-乳酸盐储备液（来自步骤2）加入990L PBS缓冲液中，以产生1mM L-乳酸盐标准溶液。

注意：稀释的L-乳酸标准溶液不稳定，应在4小时内使用。

3.2取200μL的1mM L-乳酸标准溶液进行1：3连续稀释，得到L-Lactate标准品的300,100,30,10,3,1和0μM连续稀释液。

3.3如表1和2中所述，将L-乳酸盐标准品和含L-乳酸盐的测试样品的系列稀释液加入白色透明底96孔微孔板中。

4.制备L-乳酸测定混合物：

4.1将5 mL测定缓冲液（组分B）加入一瓶酶探针（组分A）中。

4.2将50μLNAD储备溶液（100X，来自步骤1）加入到组分A的瓶子中（来自步骤4.1），并充分混合。

注意：这种L-乳酸盐测定混合物足以用于一个96孔板。 未使用的L-乳酸盐测定混合物应分成单次使用的等分试样并储存在-20℃。

5.运行L-乳酸测定：

5.1将50μLL-乳酸盐测定混合物（来自步骤4.2）添加至L-乳酸盐标准品，空白对照和测试样品（参见步骤3.3）的每个孔中以使得总L-乳酸盐测定体积为100μL/孔。

注意：对于384孔板，在每个孔中加入25μL样品和25μLL-乳酸盐测定混合物。

5.2在室温下孵育反应30分钟至2小时，避光。

5.3用A575nm / A605nm的吸光度读板仪检测吸光度比率的增加。

参考文献

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适用仪器

样品实验方案

简要概述

1.准备测试样品（50 µL）以及连续稀释的丙酮酸标准液（50 µL）
2.加入等体积的丙酮酸工作溶液（50 µL）
3.在室温下孵育30分钟至1小时
4.监测Ex / Em = 540/590 nm的荧光强度

溶液制备 

1.储备溶液

所有未使用的储备溶液应分为一次性使用的等分试样，并在制备后储存在-20°C下。 避免重复冻融循环。
1.1 Quest Fluor 丙酮酸传感器储备溶液（200X）：
将55 µL DMSO（组分E）添加到Quest Fluor 丙酮酸传感器（组分A）中，制成200X Quest Fluor 丙酮酸传感器储备溶液。

1.2 丙酮酸标准溶液（1 mM）：
将10 µL 100 mM丙酮酸盐（组分D）添加到990 µL PBS（pH 7）中，得到1 mM丙酮酸盐溶液。

2.标准溶液

丙酮酸标准
将100 µL的1 mM丙酮酸标准溶液加入900 µL PBS中制成100 µM丙酮酸溶液（PS7）。 然后执行1：3连续稀释以获得连续稀释的丙酮酸标准品（PS6-PS1）。

3.工作溶液

3.1 将5 mL测定缓冲液（组分C）加入一瓶酶混合1瓶（组分B1）中； 混合均匀。

3.2 将100μLddH₂O加入一个酶混合物2小瓶（组分B2）中； 混合均匀。

3.3 将整个小瓶（100μL）的Enzyme Mix 2和25 uL的200X Quest Fluor 丙酮酸传感器储备溶液转移到Enzyme Mix 1瓶中。 混合均匀。 注意：丙酮酸工作溶液不稳定，应立即使用，避免光照。

样品操作及实验分析

表1.黑色96孔微孔板中丙酮酸标准品和测试样品的布局。 PS =丙酮酸标准溶液（PS1-PS7，0.1至100 µM）； BL =空白对照； TS =测试样品。

表2.每个孔的试剂组成

1.根据表1和表2提供的布局，将丙酮酸标准液（PS），空白对照（BL）和测试样品（TS）制备成黑色的96孔微孔板。对于384孔板，请使用25 µL 每孔试剂，而不是50 µL。

2.在丙酮标准液，空白对照和测试样品的每个孔中加入50 µL丙酮酸工作溶液，使丙酮酸测定总体积为100 µL /孔。 对于384孔板，请向每个孔中添加25 µL工作溶液，总体积为50 µL /孔。 在6.5至7.0的pH值下运行丙酮酸盐测定。

3.将反应混合物在室温下孵育30分钟至1小时。

4.使用荧光板读数器在Ex / Em = 540/590 nm（截止：570 nm）下监测荧光的增加。

参考文献

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