病毒载体技术的进步提高了基因和细胞治疗的安全性和有效性，全球已有多种基因和细胞治疗药物被监管机构批准上市。目前大多数基因/细胞治疗方法都是利用病毒载体来实现的，其中最常用的两种病毒载体——腺相关病毒（AAV）载体常被用于基因治疗，而慢病毒（LV）载体则常被用于基因修饰的细胞治疗。病毒载体通常是将2-4个质粒共转入HEK293细胞生产出的，而转染试剂是病毒载体生产的关键要素之一，对转染效率和功能效价有显著影响。第一代非病毒转染方法依靠简单的线性聚合物，如聚乙烯亚胺(PEI)或脂质体将DNA转入到细胞内，但其性能并不能完全满足病毒载体的大规模生产需求。虽然人工合成转染试剂在过去30年里取得了巨大的进步，但仍然难以逾越大自然在数十亿年进化出的依靠病毒传递基因的效率。因此，优化非病毒转染性能的最佳方法是尽可能模仿出病毒转运DNA的自然机制的试剂。

上海金畔生物科技有限公司代理的Mirus转染试剂就是利用自然基因传递机制作为其化合物库的设计灵感，从中筛选出适合病毒生产的混合配方，将转染试剂与核酸的静电相互作用、细胞吸附与内吞、胞内释放、基因表达效率和降低细胞毒性等几乎所有影响转染成功率的因素全部考虑在内。通过不懈的努力，Mirus开发出了一种全新的仿生转染技术——TransIT-VirusGEN系列转染试剂，它不仅仅是基于PEI或脂质体，而是采用多组分脂质聚合物纳米复合物（LPNC），能够高效地结合和包裹DNA，将其带入悬浮或贴壁的HEK293细胞中，然后将其从细胞核内释放，以便同时满足2-4个不同的质粒的表达，这种全新的转染试剂比单独使用PEI及其衍生聚合物或脂质体的转染效率和完整病毒生产效率都有显著提高。同时，Mirus还研发出了一种完全合成的（无动物源）转染增强剂（Enhancer），与TransIT-VirusGEN转染试剂搭配使用时，可以进一步提高病毒滴度。另外，为了满足病毒载体从研发到大规模生产不同阶段的需求，Mirus分别推出了R&D、SELECT和GMP三种级别的TransIT-VirusGEN转染系列产品，以适应不同阶段病毒载体的生产规模、效率以及法规要求。

实验表明，Mirus基于LPNC的转染试剂可以在不同的细胞培养平台（贴壁和悬浮）、生物反应器和培养基类型中提高病毒产量和功能性病毒滴度。与业内其他金标准相比，在不使用增强剂的情况下，病毒滴度至少可提高2-4倍。而在加入增强剂之后，在合适的培养条件下，病毒产量甚至能够提高10倍以上！（结果见下图1-5）

图1. 基于脂质聚合物纳米复合物（LPNC）和聚乙烯亚胺（PEI）配方的转染试剂用于腺相关病毒(AAV)和慢病毒(LV)载体生产的性能对比。分别用基于LNPC的TransIT-VirusGEN试剂（不含增强剂与含增强剂）、25kda PEI和基于PEI技术的竞争品牌A3转染试剂产生AAV（左）和LV（右）。以LPNC为基础的TransIT-VirusGEN转染试剂比以PEI为基础的转染试剂的病毒颗粒表达量高3-5倍。当TransIT-VirusGEN和增强剂同时使用时，比单独使用TransIT-VirusGEN大约提升了一倍。转染试剂 : DNA的比值为体积 : 质量。

图2. TransIT-VirusGEN转染试剂在不同细胞培养基中的表现。使用 Fisher Scientific公司的病毒生产细胞进行转染，该细胞适应四种不同的培养基配方，分别来自 Fisher公司的LV-MAX培养基、Expi293表达培养基、FreeStyle F17表达培养基和来自Irvine Scientific公司的BalanCD HEK293培养基。后一种培养基的AAV总效价较高，但在所有使用的培养基中，无论是否添加增强剂，TransIT-VirusGEN转染试剂均表现优异。DNA与转染试剂配比为2μg DNA ：3μl转染试剂，转染细胞密度为2.0×106个/ml。生产LV也获得了类似的结果(数据未显示)。

图3. 分别在四种不同的转染条件和两个不同的收获时间，测定TransIT-VirusGEN转染试剂和PEI为基础的转染试剂A3的物理滴度和功能滴度。利用Expi293F细胞生产AAV2-GFP。转染48小时和72小时后收获的病毒分别测定功能滴度TU/mL（左）和物理滴度GC/mL（右）。结果显示用TransIT-VirusGEN转染试剂和增强剂转染收获的病毒效价最高。此外，TransIT-VirusGEN转染试剂比PEI为基础的转染试剂的表达更快。这些结果表明，对于病毒滴度的评估，功能滴度可能是一个更可靠的指标。因此，建议测试几个不同的收获时间点来确定最佳方案。

图4. 每种培养体系都应优化转染时的细胞融合度和接种密度。用DMSO+10%胎牛血清培养贴壁的HEK293t/17细胞生产慢病毒（1μg DNA/mL）。试剂盒包括TransIT-VirusGEN转染试剂、VirusGEN LV复合物形成溶液和VirusGEN LV增强剂。

图5. 在Expi293表达培养基中培养Expi293F细胞，使用VirusGEN AAV转染试剂盒，内含TransIT-VirusGEN转染试剂、VirusGEN AAV复合物形成溶液和VirusGEN AAV增强剂，在悬浮细胞培养中生产AAV。分别用2:1（左）和3:1（右）两种比例来确定理想的转染试剂和DNA配比（体积：质量）。每种转染体系都应对转染试剂: DNA配比及每毫升细胞所需的总DNA量进行优化。

TransIT-VirusGEN转染系列产品信息

美国Mirus公司成立于1995年，是世界上很早开发高效、低毒转染试剂的公司之一，同时也是目前该类试剂主要的供应商之一。Mirus被公认为转染试剂开发的领跑者，其许多杰出成果获得世界公认与广大用户的好评。

上海金畔生物科技有限公司是Mirus中国区代理，始终秉承着专业、严谨的态度为客户提供优质的产品与服务。如果您对上述产品感兴趣，欢迎致电上海金畔客服热线021-50837765或登录网站www.jinpanbio.cn了解更多产品信息或申请试用。

引用文献：

Addressing Critical Issues in Cell & Gene Therapy, Snow, J.

（https://www.mirusbio.com/assets/technical-documents/addressing-critical-issues-in-cell-gene-therapy.pdf）

不论是细胞治疗还是基因治疗都离不开病毒载体。目前使用最多的病毒载体类型包括：腺相关病毒（AAV）、慢病毒（Lv）、逆转录病毒（Rv）和腺病毒（Adv）等，这些常用病毒载体特性如下图所示：

因此在选择病毒载体时，除了要考虑载体自身特征之外，如何包装并获取高滴度高活性的病毒载体对后续实验至关重要，针对病毒载体制备5大环节，小美为您推荐如下解决方案↓
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1. 病毒载体包装质粒系统
上海金畔生物科技有限公司的美国Cell Biolabs公司推出的病毒包装系统可满足多种重组病毒包装需求，包括四大类型病毒包装质粒AAV Helper Free System、ViraSafe™ Lentivirus Expression Complete Systems、Platinum Retroviral Expression Systems以及RAPAd® Adenoviral Expression Systems等。更多病毒包装质粒系统介绍请点这里。

2. 病毒包装
A. 病毒包装专用转染试剂
上海金畔生物科技有限公司的美国Mirus公司新推出的病毒包装专用转染试剂TransIT®-VirusGEN™与TransIT®-Lenti系列，专门针对AAV和Lentivirus设计，相比传统转染方法能获得更高的转染效率和病毒滴度，无动物源成分且兼容多种病毒包装系统及不同细胞系类型。

B. Lv/Rv包装效率增强剂Lentivirus/Retrovirus 10X Titer-Up
上海金畔生物科技有限公司代理的101Bio品牌Lentivirus/Retrovirus 10X Titer-Up用于重组慢病毒或逆转录病毒包装过程，可促进病毒基因组转录和RNA稳定，使转染效率提高10倍左右。

C. AAV/Adv病毒释放液Virus-High® AAV/ADV Release Solution
上海金畔生物科技有限公司代理的101Bio品牌Virus-High® AAV/ADV Release Solution是一款无需反复冻融，即可从细胞中快速高效收获AAV/Adv病毒以及其他非分泌型无囊膜病毒的试剂。

3. 高效快速病毒浓缩试剂与纯化试剂盒
上海金畔生物科技有限公司独家代理的美国Cali-bio和Cell Biolabs品牌专门针对病毒载体设计的高效重组病毒浓缩纯化试剂（盒），在获得重组病毒高回收率的同时大大简化操作流程，无需超速离心设备，是中小规模样本纯化的首选方案。

4. 病毒滴度检测试剂盒
精确测定重组病毒滴度是提高下游实验可控性，重复性和准确性的前提，上海金畔生物科技有限公司代理的Cell Biolabs品牌针对不同病毒载体的特性分别设计的了多种滴度测定试剂盒，并且兼容了高效和精确的测定方法。

5. 病毒感染增强试剂
上海金畔生物科技有限公司代理的Cell Biolabs品牌还针对不同病毒载体研发了专用促病毒感染试剂，能显著提高病毒对靶细胞的感染，进而提高基因表达效率。

如果您对上述方案感兴趣，欢迎随时登录上海金畔网站www.jinpanbio.cn查询相关产品或拨打上海金畔生物科技有限公司全国服务热线021-50837765，小美期待您的垂询。

逆转录（也成为反转录病毒，Retrovirus）病毒载体是常用的病毒载体之一。转入宿主的细胞后，反转录病毒载体随即整合到宿主细胞基因组内，这种整合的位点是随机的。反转录病毒载体就可利用这些外壳蛋白包装成病毒颗粒在辅助细胞系内大量扩增。反转录病毒载体可以容纳外源DNA的长度在10 kb左右，以很高的转染率感染宿主细胞，特别是分裂中的细胞。

逆转录病毒通过整合进目的细胞基因组，能实现持久的表达，而且几乎没有免疫原性，因此很受欢迎。特别是和腺病毒相比，其能整合进基因组的优势导致逆转录病毒也被广泛应用，然后逆转录病毒系统也存在一定的缺陷，首先是安全性比较低，因为所有包装所需的基因都放到一个载体上，还有就是基因能整合进目的细胞也可能会导致细胞基因组的紊乱，而且其滴度比较低。由于逆转录病毒表达系统的特殊性，其包装细胞的种类较多，表达载体的种类也较多，因此需要根据不同的实际来选择合适的表达系统。Cell Biolabs的逆转录病毒表达产品包括包装细胞系、表达系统（同时包括了包装细胞和表达质粒载体）、逆转录病毒表达质粒以及插入了目的基因的重组逆转录病毒表达质粒。

Cell Biolabs提供三种铂金版逆转录病毒包装细胞系：单嗜性（Ecotropic）Plat-E包装细胞系、双嗜性（Amphotropic）Plat-A包装细胞系及泛嗜性（Pantropic）Plat-GP包装细胞系。它们对不同的细胞具有不同的侵染性。

Plat-E包装细胞系（Ecotropic）是一种来源于人胚肾(Human Embryonic Kidney, HEK)293细胞系,主要用于快速、短暂地产生高滴度逆转录病毒，同时也能用于稳定地产生逆转录病毒。由Plat-E包装细胞系产生的病毒表达一种单嗜性的被膜，因而只能感染小鼠和大鼠细胞。Plat-GP包装细胞系（Pantropic）也来源于HEK293，但却是一种泛嗜性的包装细胞系，其包装产生的逆转录病毒颗粒既能感染哺乳动物细胞，也能感染非哺乳动物细胞。在使用过程中, Plat-GP细胞需要用逆转录病毒载体和pVSV-G来共转染。VSV-G是泡状口炎病毒(Vesicular Stomatitis Virus) 的被膜糖蛋白，能通过脂质结合及质膜融合来介导病毒进入细胞。因此在使用Plat-GP细胞系时，还需要额外的使用pVSV-G完成包装。Plat-A包装细胞系（Amphotropic）也是一种来源于HEK293细胞的细胞，在将病毒env 基因导入该细胞时利用嘌呤霉素作为选择标记，因而对于一些使用嘌呤霉素作为筛选标记的载体无法使用。

一般来说，Plat-E是最常用的逆转录病毒包装细胞；Plat-GP则是适用性最广的逆转录包装细胞（但是需要多增加一个表达载体pVSV-G Packaging Vector提供外壳蛋白VSV-G，该外壳蛋白宿主范围非常广）；Plat-A用的比较少，但是其宿主范围比Plat-E要多一些，比如可应用于人、猴、狗来源的细胞等。

美国著名细胞产品公司Cell BioLabs为逆转录病毒研究人员提供完备的重组逆转录病毒表达系统及其相关产品和服务，产品包括逆转录病毒的最新一代表达系统，针对逆转录病毒滴度低的软肋而专门设计的逆转录病毒浓缩纯化试剂盒，逆转录病毒的快速定量，以及逆转录病毒高效转染试剂和用于包装重组逆转录病毒的包装细胞系等，几乎覆盖反转录病毒研究中的所有技术环节。如果您对上述逆转录病毒包装细胞系感兴趣，请致电021-50837765到上海金畔生物科技有限公司垂询相关的实验解决方案，或索取最新的Cell BioLabs产品资料。

安全高效的将目的基因导入人体靶细胞是成功进行基因治疗的关键之一。经典的基因导入方式（如显微注射、电穿孔、磷酸钙转染等）虽然曾在科研中起了一定的作用，但由于不能很好的解决转染率、靶向性等问题而限制了它们的应用。随着病毒学等相关学科的发展，目前基因打靶已广泛使用各种病毒为载体，AAV载体是最近几十年发展起来的一类新型载体。作为病毒载体的重要一员，AAV不具有明显的细胞毒性效应并且不会像其他病毒载体那样引起细胞强烈的免疫反应等特性，因为其在基因治疗中的应用潜力引起了人们越来越多的兴趣和关注。

由于AAV是天然的缺陷性病毒，需要提供多个因素才能导致转染发生，因此也被认为是最安全的病毒载体。同时腺相关病毒能感染分裂型和非分裂型细胞，甚至S期静止细胞，这使腺相关病毒成为很有前途和吸引力的基因治疗载体。腺相关病毒的转导过程包括病毒结合、进入细胞以及进入后的作用、核内转移和病毒第二条DNA链的合成。在这过程中，最后一步，也就是AAV第二条DNA链的合成是腺相关病毒载体转染的限速步骤。

Cell BioLabs针对腺相关病毒转染过程中的主要问题，开发出ViraDuctin™腺相关病毒转染试剂（ViraDuctin™ AAV Transduction Kit 目录号：AAV-200/AAV-201）。该试剂盒能高效提高腺相关病毒在多种细胞内的转染效率，包括传统转染方法转导较低的细胞非分裂细胞，如原代培养细胞和干细胞。该转染试剂使用便捷，只需2小时，是AAV转染非分裂细胞的首选。该试剂盒按照可转染次数分两种包装，AAV-200能进行10次6孔板或者35mm细胞培养皿的转染，货号为AAV-201的则能进行50次转染。

美国著名细胞学试剂专家Cell BioLabs为您提供高效简便的重组腺相关病毒相关产品和服务，产品包括腺相关病毒的纯化、定量和高效转染试剂。ViraBind™腺相关病毒纯化试剂盒采用特殊的纯化Matrix技术，无需超速离心，在大大减少试验时间的同时还保证了AAV的纯度。QuickTiter™腺相关病毒定量试剂盒通过检测腺相关病毒DNA含量来测定其病毒含量，只需2小时。ViraDuction™腺相关病毒转导试剂能极大的增加腺相关病毒在多种细胞内的转导效率，包括传统转染方法转导效率低的非分裂细胞，如原代培养细胞和干细胞。如果您对腺相关病毒产品感兴趣，请致电021-50837765到上海金畔生物科技有限公司垂询腺相关病毒相关的实验解决方案，或索取最新的Cell BioLabs产品资料。

在基因治疗中广泛应用的逆转录病毒载体存在的主要问题，是无法高效转导非分裂期细胞，而腺病毒载体虽然能转导非分裂期细胞，但在体内不能实现目的基因稳定的长期表达，且反复应用容易引起免疫反应。慢病毒载体不但可以感染非分裂期细胞，还具有容纳外源性目的基因片段大、免疫反应小等优点，在基因治疗中具有广泛的应用前景。

人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)改造的慢病毒载体(Lentiviral vector)既可感染分裂细胞，也可感染非分裂细胞，如神经细胞、造血干细胞、肝细胞等，还具有整合到宿主细胞基因组、稳定长效转染、感染效率高等优点，是细胞基因功能研究和基因治疗中不可多得的优良载体。目前对于慢病毒的滴度滴定大部分通过检测腺病毒内壳蛋白p24的表达来完成。而在一些商用的腺病毒载体中，由于加入了GFP标记蛋白，因此也可以通过流式细胞仪检测GFP蛋白表达水平来分析病毒滴度，病毒滴度为表达GFP的细胞数乘以相应稀释倍数。另外，还可以通过TaqManPCR检测细胞中病毒拷贝数的方法检测滴度。

上海金畔生物科技有限公司针对慢病毒定量为您推荐美国细胞生物学专业产品制造商Cell BioLabs的QuickTiter™ Lentivirus Rapid Quantitation Kit。该试剂盒较p24蛋白表达以及GFP蛋白检测更简介方便，且成本更低。Cell BioLabs慢病毒快速定量试剂盒的工作原理如右图所示，首先使用核酸酶将病毒悬液内的核酸分子降解，然后用特异性的慢病毒捕获珠子结合慢病毒，从而分离出蛋白核酸复合物，洗脱下慢病毒后进一步降解，然后标记其病毒核酸，通过480/520 nm滤镜荧光仪下读取数据，对照慢病毒RNA标准曲线得出慢病毒含量。

Cell BioLabs慢病毒快速定量试剂盒内包括溶液A、溶液B、溶液C、慢病毒捕获液、Dye染料以及慢病毒RNA标准物。该试剂盒能直接用于慢病毒悬液，定量步骤快捷，可以在45-60min内获得数据。检测灵敏，可以从100ul慢病毒上清中检测出10¹⁰VP/ml的慢病毒，足够慢病毒实验中的中、高滴度需求。

Cell BioLabs为您提供全套的慢病毒技术解决方案，ViraSafe腺病毒表达系统有多种样式供您选择；多种慢病毒滴度检测和定量试剂为您提供快捷和准确的慢病毒检测方案；ViraBind™慢病毒浓缩和纯化试剂盒采用了专利技术能让你获得更高滴度和纯度的慢病毒，解决了慢病毒低滴度的软肋；Cell BioLabs还有转为慢病毒载体用的293LTV细胞及慢病毒高效转染试剂供您选择，如果您对慢病毒产品感兴趣，请致电021-50837765到上海金畔生物科技有限公司垂询慢病毒相关的实验解决方案，或索取最新的Cell BioLabs产品资料。

通过对腺病毒基因组的改造，腺病毒载体是继逆转录病毒载体后被广泛应用的转基因载体，现已发展到第三代，转染效率高，且相对制备容易。从最早的腺病毒载体出现至今，腺病毒载体的包装系统已经经历了一系列的改进。腺病毒载体已经被广泛应用于动物细胞的基因转染和基因治疗等。

在腺病毒的应用过程中，我们经常需要测量病毒液的病毒含量以及腺病毒滴度。目前实验里做腺病毒常规滴度检测有通过TCID50或者空斑计数法（PFU）测量腺病毒感染滴度的方法，但是这种传统的方法实验周期较长，操作繁琐。如常规PFU的检测就就需要10天左右的时间。Cell BioLabs的QuickTiter™腺病毒功能滴定试剂盒，采用免疫蛋白反应的原理检测腺病毒标志性外壳蛋白——Hexon的表达含量，从而得到腺病毒液的功能滴度，只需2天多的时间就能获得比常规实验所需要10天的测量结果还要准确的数据。但是即使是这样的方法，也需耗时2天，一般说来，如果已经获得了纯化的病毒液，通过测量OD260来估算病毒颗粒的总含量不失为一种快捷的多的腺病毒定量方案。

上海金畔生物科技有限公司针对腺病毒定量为您推荐美国细胞生物学专业产品制造商Cell BioLabs的QuickTiter™ Adenovirus Rapid Quantitation Kit（目录号：VPK-106）。该试剂盒的工作原理如右图所示，首先使用核酸酶将病毒悬液内的核算分子降解，然后用特异性的腺病毒捕获珠子结合腺病毒，从而分离出蛋白核酸复合物，洗脱下腺病毒后进一步降解，然后标记其病毒核酸，通过480/520 nm滤镜荧光仪下读取数据，对照腺病毒DNA标准曲线得出腺病毒滴度。

Cell BioLabs腺病毒快速定量试剂盒内包括溶液A、溶液B、溶液C、腺病毒捕获液、Dye染料以及腺病毒DNA标准物。该试剂盒不仅能直接用于已纯化的病毒悬液，对于未纯化的腺病毒，该试剂提供快速纯化试剂，您可以在纯化前通过该kit测算出病毒悬液上清中的腺病毒含量，也可以使用该Kit内的纯化试剂先进行纯化步骤。整个腺病毒定量步骤快捷，可以在45-60min内获得数据，检测灵敏。

另外，该定量试剂盒不仅能应用于腺病毒，由于是通过OD260测量核酸含量从而通过与标准曲线的比对得出腺病毒的含量，因此还能应用于其他的病毒定量。如反转录病毒，慢病毒等。 

Cell BioLabs为您提供全套的腺病毒技术解决方案，RAPAD®腺病毒表达系统有多种样式供您选择，还有预装有多种重组基因的腺病毒供您直接使用，ViraBind™腺病毒小提及中提大提试剂盒采用了专利技术能让你获得更高滴度和纯度的腺病毒，Cell BioLabs还有转为腺病毒载体用的293AD细胞及高效转染试剂供您选择，如果您对腺病毒产品感兴趣，请致电021-50837765到上海金畔生物科技有限公司垂询腺病毒相关的实验解决方案，或索取最新的Cell BioLabs产品资料。