病毒污染是生物制品生产过程中一项不可忽视的潜在风险，不仅可能导致药物研发失败，还会影响药品安全及患者健康。中国NMPA、美国FDA、欧洲CPMP/BWP以及ICH等药品监管机构都要求制药企业对产品中病毒清除/灭活的情况进行验证。此外，各机构对产品研发的不同阶段所需要验证的项目和标准也有所不同。例如，在IND阶段就需要验证工艺对逆转录病毒、细小病毒和疱疹病毒的清除能力。常规的病毒清除验证方法需要使用活病毒来完成，对生物安全级别要求很高，常规实验室内难以进行。为了解决这一问题， Cygnus technologies新推出了用于模拟逆转录病毒清除验证的试剂盒MockV® RVLP Kit (M230)，该试剂盒内提供了一种非感染性逆转录病毒样颗粒（RVLP），使研发人员可以在BSL-1实验室中也能简单轻松的进行病毒清除验证研究，有助于加速研发或临床试验的进程。

• 采用非感染性逆转录病毒样颗粒（RVLP），BSL-1实验室可以使用
• 检测过程简单易操作：预处理样品、提取RNA、qPCR定量
• 可应用于QbD、DOE和HTS方法
• 节省研发时间和成本

RVLP是CHO细胞在实际生产过程中会产生的一种非传染性逆转录病毒污染物。从1990年开始，FDA等全球监管机构就意识到这种颗粒的流行，开始关注CHO衍生物逆转录病毒的安全性问题。从那时起，XMuLV（异嗜性鼠白血病病毒（XMuLV））被当做逆转录病毒模型而使用，用以证明病毒清除的有效性。随着MockV® RVLP kit的推出，现在可以使用原始逆转录病毒颗粒来独立进行病毒清除研究。

RVLP与XMuLV的直径(fig.1) 和净表面电荷 (fig.2)的特性非常相似。

Cygnus Technologies, LLC.为生物技术和生物制药行业提供可靠的产品和分析方法，旨在加速研发阶段和提高产品质量。Cygnus开发和生产的生物工艺残留试剂盒，用于检测超过50种不同表达系统的特异性杂质。Cygnus作为专注于生物技术应用免疫检测的高灵敏度分析技术的专家，其产品和服务已经被几乎所有主要的生物制药公司使用超过25年。

上海金畔生物科技有限公司作为Cygnus在中国一级代理，与国内众多知名药企，CRO/CMO企业建立了长久稳定的合作关系。多年来上海金畔生物科技有限公司的产品及服务帮助许多企业加速R&D阶段，提高药物质量、纯度和安全，加速优化研发工艺，减少产品上市时间，降低QC成本。如您对上述产品感兴趣，欢迎致电上海金畔生物科技有限公司客服热线021-50837765或者登陆网站www.jinpanbio.cn了解更多信息。

胰蛋白酶是一种丝氨酸蛋白酶，存在于大多数哺乳动物的消化系统中，传统的细胞培养一直使用动物胰腺来源的胰蛋白酶，但是动物源胰蛋白酶存在动物源病毒（疯牛病病毒、朊病毒和猪口蹄疫病毒等）的潜在危险。自2018年非洲猪瘟疫情在中国爆发以来，外源病毒污染的风险进一步被重视，重组胰蛋白酶作为一种安全有效的替代产品，在细胞培养及生物制药中越来越受到青睐，广泛应用于细胞消化传代、病毒疫苗生产、干细胞培养、细胞治疗和原代细胞培养过程的分离和收获及重组胰岛素生产等众多领域。

Kerry Sheffield™ rTrypsin ACF重组胰蛋白酶是利用宿主天然氨基酸序列，通过真菌发酵生产，生产过程中不添加任何动物源成分，无外源病毒污染风险，安全性高，纯度高，活性强，具有与猪胰蛋白酶相似的氨基酸切割特异性。与天然胰蛋白酶一样，重组胰蛋白酶在赖氨酸和精氨酸的羧基侧切割肽键，是天然胰蛋白酶的可行替代品。Sheffield™ rTrypsin重组胰蛋白酶也被推荐用于HEK、Vero、MRC-5等贴壁细胞系。

监管相关文件及政策

国家药监局于2019年9月发布了《疫苗上市后生产工艺变更研究技术指导原则》（征求意见稿），如果疫苗生产要进行符合药典标准的原辅料变更，只需备案，即通过变更流程的简化，鼓励企业进行无动物源性原辅料的变更。

中国药典2020版三部“生物制品病毒安全性控制”章节中明确指出：“原材料及辅料应符合‘生物制品生产用原材料及辅料质量控制’的相应要求，应尽可能选择无病毒安全性风险或低风险的原材料和辅料用于生物制品生产，如选择采用重组技术生产的生物材料替代动物源性生物材料”，并增加了重组胰蛋白酶的质量标准（中国药典2020年版3603）。相关实验数据

图1 .无动物成分的rTrypsins具有与天然Trypsin相同的细胞分离效果。

图3 . Sheffield™rTrypsin和其他市售重组胰蛋白酶均未发现明显毒性。

图4 . 所有rTrypsins消化传代后的细胞倍增水平显示这些rTrypsins对细胞没有明显毒性。

实验结果显示，所有的胰蛋白酶在都能有效地分离单层细胞，表明rTrypsin可以代替天然胰蛋白酶进行细胞分离(图1 )。然而，这些被评估的胰蛋白酶都不能完全分离紧密的细胞团块。在消化单细胞层所需的时间方面，与其它商品化rTrypsin相比，Kerry Sheffield™ rTrypsin酶解速度更快(图2A & B )。细胞毒性研究表明，所有市售rTrypsins的细胞活率和细胞倍增时间均相近，表明重组胰蛋白酶对细胞无明显毒性(图3、4 )。

Kerry Sheffield™rTrypsin ACF重组胰蛋白酶的优点：

• ​无动物源成分( ACF ) ；
• 更快的细胞解离速度；
• 细胞倍增时间更短且细胞活率更高；
• 是传统动物源胰酶更经济高效的替代品；
• 应用广泛，适用多种细胞类型

Kerry Sheffield™rTrypsin ACF产品列表

免费试用申请

为了满足广大客户的需求，Sheffield™rTrypsin ACF免费试用活动正式开启，即日起至2023年1月31日，关注“上海金畔生物科技有限公司微信公众号（微信号jinpanbio）”，发送关键词“重组胰酶”，填写试用调查问卷即可获得免费试用机会，数量有限，先到先得。

美国Kerry集团旗下Sheffield Bio-Science服务于全球超过70年，作为全球生物制药疫苗行业规模大专业性强的细胞营养原料供应商，已成为全球单个药物年销售额超过10亿美金的10个“生物炸弹药”中7个生物药的培养基原料供应商，是全球少有的同时生产酵母粉和蛋白胨并针对不同细胞株/菌种开发提供非动物源性复合添加物系统的生产商，引领全球制药、疫苗、无血清培养基、传统发酵和诊断培养基工业的发展。

上海金畔生物科技有限公司为Kerry集团细胞培养系列产品中国一级代理，为客户提供完善的技术支持与售后服务。欢迎拨打上海金畔生物科技有限公司客服电话021-50837765或者登陆网站www.jinpanbio.cn了解更多信息。

病毒载体技术的进步提高了基因和细胞治疗的安全性和有效性，全球已有多种基因和细胞治疗药物被监管机构批准上市。目前大多数基因/细胞治疗方法都是利用病毒载体来实现的，其中最常用的两种病毒载体——腺相关病毒（AAV）载体常被用于基因治疗，而慢病毒（LV）载体则常被用于基因修饰的细胞治疗。病毒载体通常是将2-4个质粒共转入HEK293细胞生产出的，而转染试剂是病毒载体生产的关键要素之一，对转染效率和功能效价有显著影响。第一代非病毒转染方法依靠简单的线性聚合物，如聚乙烯亚胺(PEI)或脂质体将DNA转入到细胞内，但其性能并不能完全满足病毒载体的大规模生产需求。虽然人工合成转染试剂在过去30年里取得了巨大的进步，但仍然难以逾越大自然在数十亿年进化出的依靠病毒传递基因的效率。因此，优化非病毒转染性能的最佳方法是尽可能模仿出病毒转运DNA的自然机制的试剂。

上海金畔生物科技有限公司代理的Mirus转染试剂就是利用自然基因传递机制作为其化合物库的设计灵感，从中筛选出适合病毒生产的混合配方，将转染试剂与核酸的静电相互作用、细胞吸附与内吞、胞内释放、基因表达效率和降低细胞毒性等几乎所有影响转染成功率的因素全部考虑在内。通过不懈的努力，Mirus开发出了一种全新的仿生转染技术——TransIT-VirusGEN系列转染试剂，它不仅仅是基于PEI或脂质体，而是采用多组分脂质聚合物纳米复合物（LPNC），能够高效地结合和包裹DNA，将其带入悬浮或贴壁的HEK293细胞中，然后将其从细胞核内释放，以便同时满足2-4个不同的质粒的表达，这种全新的转染试剂比单独使用PEI及其衍生聚合物或脂质体的转染效率和完整病毒生产效率都有显著提高。同时，Mirus还研发出了一种完全合成的（无动物源）转染增强剂（Enhancer），与TransIT-VirusGEN转染试剂搭配使用时，可以进一步提高病毒滴度。另外，为了满足病毒载体从研发到大规模生产不同阶段的需求，Mirus分别推出了R&D、SELECT和GMP三种级别的TransIT-VirusGEN转染系列产品，以适应不同阶段病毒载体的生产规模、效率以及法规要求。

实验表明，Mirus基于LPNC的转染试剂可以在不同的细胞培养平台（贴壁和悬浮）、生物反应器和培养基类型中提高病毒产量和功能性病毒滴度。与业内其他金标准相比，在不使用增强剂的情况下，病毒滴度至少可提高2-4倍。而在加入增强剂之后，在合适的培养条件下，病毒产量甚至能够提高10倍以上！（结果见下图1-5）

图1. 基于脂质聚合物纳米复合物（LPNC）和聚乙烯亚胺（PEI）配方的转染试剂用于腺相关病毒(AAV)和慢病毒(LV)载体生产的性能对比。分别用基于LNPC的TransIT-VirusGEN试剂（不含增强剂与含增强剂）、25kda PEI和基于PEI技术的竞争品牌A3转染试剂产生AAV（左）和LV（右）。以LPNC为基础的TransIT-VirusGEN转染试剂比以PEI为基础的转染试剂的病毒颗粒表达量高3-5倍。当TransIT-VirusGEN和增强剂同时使用时，比单独使用TransIT-VirusGEN大约提升了一倍。转染试剂 : DNA的比值为体积 : 质量。

图2. TransIT-VirusGEN转染试剂在不同细胞培养基中的表现。使用Thermo Fisher Scientific公司的病毒生产细胞进行转染，该细胞适应四种不同的培养基配方，分别来自Thermo Fisher公司的LV-MAX培养基、Expi293表达培养基、FreeStyle F17表达培养基和来自Irvine Scientific公司的BalanCD HEK293培养基。后一种培养基的AAV总效价较高，但在所有使用的培养基中，无论是否添加增强剂，TransIT-VirusGEN转染试剂均表现优异。DNA与转染试剂配比为2μg DNA ：3μl转染试剂，转染细胞密度为2.0×106个/ml。生产LV也获得了类似的结果(数据未显示)。

图3. 分别在四种不同的转染条件和两个不同的收获时间，测定TransIT-VirusGEN转染试剂和PEI为基础的转染试剂A3的物理滴度和功能滴度。利用Expi293F细胞生产AAV2-GFP。转染48小时和72小时后收获的病毒分别测定功能滴度TU/mL（左）和物理滴度GC/mL（右）。结果显示用TransIT-VirusGEN转染试剂和增强剂转染收获的病毒效价最高。此外，TransIT-VirusGEN转染试剂比PEI为基础的转染试剂的表达更快。这些结果表明，对于病毒滴度的评估，功能滴度可能是一个更可靠的指标。因此，建议测试几个不同的收获时间点来确定最佳方案。

图4. 每种培养体系都应优化转染时的细胞融合度和接种密度。用DMSO+10%胎牛血清培养贴壁的HEK293t/17细胞生产慢病毒（1μg DNA/mL）。试剂盒包括TransIT-VirusGEN转染试剂、VirusGEN LV复合物形成溶液和VirusGEN LV增强剂。

图5. 在Expi293表达培养基中培养Expi293F细胞，使用VirusGEN AAV转染试剂盒，内含TransIT-VirusGEN转染试剂、VirusGEN AAV复合物形成溶液和VirusGEN AAV增强剂，在悬浮细胞培养中生产AAV。分别用2:1（左）和3:1（右）两种比例来确定理想的转染试剂和DNA配比（体积：质量）。每种转染体系都应对转染试剂: DNA配比及每毫升细胞所需的总DNA量进行优化。

TransIT-VirusGEN转染系列产品信息

美国Mirus公司成立于1995年，是世界上很早开发高效、低毒转染试剂的公司之一，同时也是目前该类试剂主要的供应商之一。Mirus被公认为转染试剂开发的领跑者，其许多杰出成果获得世界公认与广大用户的好评。

上海金畔生物科技有限公司是Mirus中国区代理，始终秉承着专业、严谨的态度为客户提供优质的产品与服务。如果您对上述产品感兴趣，欢迎致电上海金畔客服热线021-50837765或登录网站www.jinpanbio.cn了解更多产品信息或申请试用。

引用文献：

Addressing Critical Issues in Cell & Gene Therapy, Snow, J.

（https://www.mirusbio.com/assets/technical-documents/addressing-critical-issues-in-cell-gene-therapy.pdf）

不论是细胞治疗还是基因治疗都离不开病毒载体。目前使用最多的病毒载体类型包括：腺相关病毒（AAV）、慢病毒（Lv）、逆转录病毒（Rv）和腺病毒（Adv）等，这些常用病毒载体特性如下图所示：

因此在选择病毒载体时，除了要考虑载体自身特征之外，如何包装并获取高滴度高活性的病毒载体对后续实验至关重要，针对病毒载体制备5大环节，小美为您推荐如下解决方案↓
（图片2）

1. 病毒载体包装质粒系统
上海金畔生物科技有限公司的美国Cell Biolabs公司推出的病毒包装系统可满足多种重组病毒包装需求，包括四大类型病毒包装质粒AAV Helper Free System、ViraSafe™ Lentivirus Expression Complete Systems、Platinum Retroviral Expression Systems以及RAPAd® Adenoviral Expression Systems等。更多病毒包装质粒系统介绍请点这里。

2. 病毒包装
A. 病毒包装专用转染试剂
上海金畔生物科技有限公司的美国Mirus公司新推出的病毒包装专用转染试剂TransIT®-VirusGEN™与TransIT®-Lenti系列，专门针对AAV和Lentivirus设计，相比传统转染方法能获得更高的转染效率和病毒滴度，无动物源成分且兼容多种病毒包装系统及不同细胞系类型。

B. Lv/Rv包装效率增强剂Lentivirus/Retrovirus 10X Titer-Up
上海金畔生物科技有限公司代理的101Bio品牌Lentivirus/Retrovirus 10X Titer-Up用于重组慢病毒或逆转录病毒包装过程，可促进病毒基因组转录和RNA稳定，使转染效率提高10倍左右。

C. AAV/Adv病毒释放液Virus-High® AAV/ADV Release Solution
上海金畔生物科技有限公司代理的101Bio品牌Virus-High® AAV/ADV Release Solution是一款无需反复冻融，即可从细胞中快速高效收获AAV/Adv病毒以及其他非分泌型无囊膜病毒的试剂。

3. 高效快速病毒浓缩试剂与纯化试剂盒
上海金畔生物科技有限公司独家代理的美国Cali-bio和Cell Biolabs品牌专门针对病毒载体设计的高效重组病毒浓缩纯化试剂（盒），在获得重组病毒高回收率的同时大大简化操作流程，无需超速离心设备，是中小规模样本纯化的首选方案。

4. 病毒滴度检测试剂盒
精确测定重组病毒滴度是提高下游实验可控性，重复性和准确性的前提，上海金畔生物科技有限公司代理的Cell Biolabs品牌针对不同病毒载体的特性分别设计的了多种滴度测定试剂盒，并且兼容了高效和精确的测定方法。

5. 病毒感染增强试剂
上海金畔生物科技有限公司代理的Cell Biolabs品牌还针对不同病毒载体研发了专用促病毒感染试剂，能显著提高病毒对靶细胞的感染，进而提高基因表达效率。

如果您对上述方案感兴趣，欢迎随时登录上海金畔网站www.jinpanbio.cn查询相关产品或拨打上海金畔生物科技有限公司全国服务热线021-50837765，小美期待您的垂询。