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流式细胞分析方案主要步骤以及流式免疫检测

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流式细胞分析方案主要步骤以及流式免疫检测

流式细胞分析方案主要分为4个步骤：  

  • 样品制备：应通过机械分离方法或化学解离技术制备单细胞悬液，如采用酶溶液或钙螯合试剂。

  • 封闭：通常采用抗Fc抗体稀释液悬浮细胞，防止一抗非特异性结合。

  • 抗体孵育：流式细胞分析的孵育步骤涉及多种组分，包括一抗、二抗、链霉亲和素和荧光染料。

  • 数据采集：大多数流式细胞仪都配备获取和转化细胞特征信号必需的软件。用户可根据自身实验要求设定具体的软件参数。

适当的对照

除了目标细胞之外，每次进行流式细胞实验还应包含以下对照：

  • 至少一份未染色样品，与试样同时进行每一步的缓冲液孵育，以优化实验的流速和电压。

  • 一份适当的阴性对照样品，与试样基本相同，但用在一抗的宿主种属中生产的同型对照替代试样中的一抗。该对照用于非特异性结合二抗。

  • 如有需要也可准备一份已知表达所有目标抗原的细胞组成的阳性对照，并与试样共同孵育，但仅用单色检测。

流式免疫检测

同其他免疫检测应用一样，流式细胞分析也可通过多种方法利用抗体探测特定的细胞基元。两大常用方法为：直接检测法和间接检测法。

直接检测法

直接检测法是一种一步染色工艺，通过一抗特异性结合目标抗原，可直接结合支持成像或其他结合状态检测的分子。探测位于细胞表面的抗原时，不建议固定细胞，否则可能导致抗体探针无法接触目标抗原。因此，在数据采集结束前保持细胞活力十分重要。如要查找直接检测法的抗体，可采用Antibody Explorer抗体搜索工具，将Search Within（搜索范围）设为“Primary Antibodies Only”（仅限一抗），application（应用）选择“flow cytometry”（流式细胞分析）。

间接检测法

间接检测法先用纯化抗体与目标抗原孵育结合，再用荧光染料标记的二抗（特异性靶向一抗宿主同型）与一抗特异性结合，形成一抗-荧光二抗复合物。采用纯化一抗搭配各种波长（或颜色）的荧光染料标记二抗（特异性针对生产一抗的宿主同型）可提升抗体库的模块化程度。

细胞复苏时血清更换注意事项及步骤

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细胞复苏时血清更换注意事项及步骤

血清更换注意事项及步骤

一、推荐在复苏时步骤：

1.首先准备一只15ml离心管，加入3倍以上体积培养基（含10%澳范血清，1%青链霉素的适配培养基，具体培养基类型查询ATCC）。

2.将需要复苏的冻存管放于37℃水浴锅中（液面没过冻存液），并持续轻柔晃动冻存管，直至冰晶消失。

2.迅速转移细胞至无菌操作台，酒精棉球擦拭干净冻存管表面后开盖。

3.轻柔地将细胞转移至已经准备好的无菌离心管，800-1000g离心5min（不同离心机离心力不同，请选择合适离心力），弃去上清，用上述培养基重悬细胞，放入37℃，5%二氧化碳培养箱培养。并隔天更换培养基。

二、对于对数生长期的细胞，推荐按梯度更换血清：

         将上述培养基与之前所使用培养基按1：1混匀后，采用换液法更换培养基。持续培养1代后更换为只含10%澳范血清的培养基。（其余所需物质照常添加）

三、不推荐直接更换血清：

        可能导致细胞营养不良，形态变皱缩/纤细，代谢和活性相关表型改变。

血清储存及化冻

储存：在 -15°C到-20°C低温冰箱血清的保存期限为5年。

 

解冻：第一步：从-40°C–80°C超低温冰箱取出后需在 -20°C冰箱平衡48小时。

           第二步：立放与水平摇床并开启摇床。若解冻血清的时候无法使用摇床则在室温下融化，前半小时内每隔5分钟-10分钟轻微晃动血清使其瓶底及瓶身周边的纤粘蛋白融化。

4度冰箱解冻血清容易造成析出并丢失贴壁因子、会影响细胞的培养。

 

解析：血清中含有冷不溶蛋白较多如血清中纤粘蛋白（fibronection）属于冷不溶蛋白，在4度解冻时，不会溶解，是以沉淀状态在血清中。

           冰箱存在自动化霜功能，冰箱在化霜过程中箱体处于加热状态、贴近箱体底部及周边储存的试剂容易被溶解反复冻融影响质量。实验室使用化霜冰箱的时候存放试剂时需避免直接存放在锡箔纸上面。

使用celldata核酸提取试剂盒进行核酸提取的步骤

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使用celldata核酸提取试剂盒进行核酸提取的步骤

　　celldata核酸提取试剂盒是一种用于从各种细胞系和组织中提取核酸的实验工具。核酸是细胞内携带遗传信息的分子，包括脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。正确提取和纯化核酸对于基因表达和遗传研究非常重要。
 
　　该试剂盒的优点在于其使用简便，能够高效地从细胞中提取出高质量的核酸。该试剂盒包含一系列试剂和步骤，旨在很大限度地减少核酸降解和污染，以确保提取出的核酸具有高纯度和高得率。
 
　　使用celldata核酸提取试剂盒进行核酸提取的步骤包括：
 
　　1、细胞裂解：通过加入试剂盒中的细胞裂解液，快速裂解细胞并释放出核酸。
 
　　2、蛋白沉淀：加入蛋白沉淀剂，去除细胞中的蛋白质，将核酸从蛋白质中分离出来。
 
　　3、酚氯仿抽提：通过酚氯仿抽提，去除核酸中的有机溶剂和蛋白质。
 
　　4、氯仿抽提：氯仿抽提进一步去除有机溶剂和其他杂质。
 
　　5、乙醇沉淀：加入无水乙醇，使核酸沉淀并从溶液中分离出来。
 
　　6、洗涤和干燥：通过洗涤和干燥，去除核酸上的残留有机溶剂和其他杂质。
 
　　7、溶解：将核酸溶解在适当的缓冲液中，以便进行后续的分子生物学实验。
 
　　该试剂盒适用于多种类型的细胞系和组织，包括哺乳动物、植物、细菌等。此外，试剂盒还具有高灵敏度和快速提取时间的特点，能够满足科研实验室对核酸提取的高要求。
 
　　celldata核酸提取试剂盒是一种用于提取高质量核酸的重要工具，适用于多种类型的细胞系和组织。其简便的使用方法和高效地提取效果，为分子生物学研究和基因表达分析提供了强有力的支持。

PI单染法实验原理及步骤

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PI单染法实验原理及步骤

PI单染的原理主要是根据细胞凋亡过程中细胞、亚细胞和分子水平发生的特征性变化。这些变化包括细胞核的变化、细胞器的变化、细胞膜成分的变化和细胞形态的变化，其中细胞核的变化很有特征。

PI简介

荧光染料PI（碘化丙啶）是一种可以对DNA进行染色的核染色试剂。它常用于细胞凋亡检测。英文全称是Propidium Iodide。它是一种溴化乙锭类似物，嵌入双链 DNA 后会发出红色荧光。虽然 PI 不能穿过活细胞膜，但它可以穿过受损的细胞膜并对细胞核进行染色。 PI 通常与 Calcein-AM 或 FDA 等荧光探针一起使用，以同时对活细胞和死细胞进行染色。 PI-DNA复合物的激发波长和发射波长分别为535 nm和615 nm。

外观：红棕色粉末储存条件：-20℃

PI单染法实验原理

1、细胞核的变化：由于凋亡细胞细胞核的变化，导致各种染色体荧光染料对凋亡细胞DNA的染色性发生改变。研究表明，用各种染色体荧光染料对固定的凋亡细胞进行染色会降低 DNA 染色能力。许多学者将 DNA 染色性的降低视为凋亡细胞的标志之一。

2.光散射特性：凋亡细胞形态的变化影响其光散射特性。在流式细胞仪上，前向散射光与细胞的大小有关，而侧向散射光反映了细胞内光的折射，与细胞内颗粒的数量有关。细胞凋亡时，细胞收缩，体积变小，因此前向散射光减少。这一特征通常被认为是凋亡细胞的特征之一。另外，由于细胞凋亡时染色体的降解和核破裂的形成，细胞内颗粒常增多，故凋亡细胞的侧向散射光常增多。细胞坏死时，由于细胞肿胀，前向散射光增加；细胞坏死时侧向散射光也增加，因此根据前向散射光和侧向散射光可以区分凋亡细胞和坏死细胞。但需要注意的是，根据前向散射光和侧向散射光判断凋亡细胞的可靠性，很大程度上受检测细胞形态的均匀性和核质比的影响。因此，在某些淋巴细胞凋亡中，通过光散射特性检测细胞凋亡的可靠性较好，但在肿瘤细胞凋亡中，其可靠性较差。基于光散射特性检测凋亡细胞的主要优点是，光散射特性可以与细胞的表面免疫荧光分析相结合，以区分经过这些特殊处理后发生选择性凋亡的淋巴细胞亚型。它还可用于活细胞的分类。

PI 单染试剂和仪器

1、PBS溶液；
2、PI染色液：将PI溶解于PBS(pH7.4)中，终浓度为100ug/ml。储存在棕色瓶中，4°C 避光保存。
3,70%乙醇4,400目筛5，流式细胞仪

PI单染实验步骤

1.收集细胞，500~1000r/min离心5min，弃去培养基。
2.用3ml PBS洗涤一次。
3. 离心除去PBS，加入冰冷的70%乙醇固定，4℃固定1-2小时。
4. 离心弃固定液，重悬于 3ml PBS 中 5 分钟。
5. 过400目筛一次，500-1000 r/min离心5 min，弃PBS。
6. 用1ml PI染色液染色，4℃避光30min。
7、流式细胞仪检测：PI被氩离子激发产生荧光，激光光波波长为488nm，发射光波波长大于630nm，产生红色荧光，分析荧光直方图PI的强度，并分析前向散射光到侧向散射光的散射。图片。
8.结果判断：在前向散射光与侧向散射光的散点图或地形图上，与正常细胞相比，凋亡细胞的前向散射光较低，而侧向散射光可高可低，这与正常细胞相比，凋亡细胞的前向散射光较低，而侧向散射光可高可低。细胞类型；在分析PI荧光直方图时，首先使用门技术排除双或聚集的细胞以及发出微弱荧光的细胞碎片。在PI荧光直方图上，凋亡细胞在G1/G0期倍性峰之前出现一二二。例如，如果G1/G0期位置的荧光强度为1.0，则典型凋亡细胞样品的亚二倍体峰的荧光强度为0.45，则可以使用鸡和鲑鱼红细胞的PI荧光强度作为参考标准。 0.35 和 0.7，分别确保其间不是细胞碎片而是完整的细胞。

注：在细胞凋亡过程中，DNA 染色性的降低被认为是凋亡细胞的标志之一，但这种 DNA 染色性的降低也可能是由于 DNA 含量的减少，或由于 DNA 结构的变化所致。这是由于其与染料结合的能力发生变化引起的。分析结果时应小心。

双染法免疫荧光组织化学染色步骤

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双染法免疫荧光组织化学染色步骤

如果同一标本中需要同时显示A、B两种抗原，则A抗原的抗体用FITC标记，B抗原的抗体用TRITC标记，可采用以下染色方法用过的：

免疫荧光细胞化学双染

原代培养的大鼠端脑细胞第14天胚胎：在成骨形态蛋白的诱导下，乙酰胆碱转移酶（绿色荧光）和同源结构域蛋白Islet-1（红色荧光）共存于细胞质中（激光扫描共存）。聚焦显微镜观察）

1.一步双染法，将两种荧光标记抗体按适当比例（A+B）混合，按照直接法进行染色。

2.两步双染法，先用TRITC标记的抗体A进行免疫荧光染色，然后用FITC标记的抗体B进行免疫荧光染色。根据两种抗体的动物种类，可以采用直接法或间接法。结果是A抗原呈橙红色荧光，而B抗原呈黄绿色荧光。在应用中，常用的方法是免疫荧光组织化学中的间接法与荧光染料SABC-Cy3法的结合。例如，在实验设计中，选择小鼠抗大鼠A和兔抗大鼠B作为两种不同的特异性一抗，匹配的二抗分别为FITC-抗小鼠IgG和生物素化抗兔。免疫球蛋白G。

进行双染时，由于两种一抗来源不同，可能会混合一抗。孵育后，清洗未结合的一抗。滴加二抗时，先加入人生物素化抗兔IgG（二抗）孵育。清洗后，滴下 SABC-Cy3 复合物。特异性荧光，然后与FITC-抗小鼠IgG（二抗）孵育，最后封片观察。结果，A抗原显示绿色荧光，B抗原显示红色荧光。

该方法中需要注意的是，两种一抗混合稀释时，抗体的终浓度应为每种抗体的工作浓度。也就是说，混合液要同时满足两种一抗的工作浓度。如果两个一抗来自同一物种，则必须进行两次双染，即A抗原先用第一个一抗和第一个荧光二抗染色，然后用第二个一抗和第一个荧光二抗洗涤荧光二抗。 B抗原染色需使用两种荧光二抗，否则会发生交叉反应，导致染色不特异。

进行细胞计数时要进行哪些步骤

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进行细胞计数时要进行哪些步骤

　　常用的计数方法主要有手工计数(如利用改良牛鲍计数板)和细胞计数仪计数(经费充裕组常备)。从原理来说，这两种方法基本类似，大致是通过台盼兰或者荧光染料染色后，用肉眼或者用摄像机拍照后进行计数，差别就是前者人累，且精准度和稳定性较差；后者不累人，且精准度和稳定性较好。
　　单细胞测序实验的第一步是单细胞悬液的制备，而悬液制备中细胞计数的准确性直接影响单细胞测序的数据质量。
　　1.  计数板
　　用96%酒精冲洗计数板后，用干净鹿皮擦净，另擦净盖片一张；把盖片覆在计数板上面，使之微微移向一侧，露出计数板台面少许，以便滴加细胞悬液；
　　2.  染色
　　取吸管1 支，伸入培养瓶中，轻轻反复吹打细胞悬液使细胞重悬均匀后，立即吸细胞悬液少许，向另一离心管中滴入细胞悬液9 滴，再滴入台盼蓝染液1 滴，混匀，置2~3 分种；
　　3.  加悬液
　　把计数板平放在显微镜台上，立即从计数板边缘轻轻滴1~2 滴已染色的细胞悬液，使之充满计数板和盖片间空隙中；
　　4.  镜检
　　镜下观察可见细胞分散各处，健康细胞胞体完整，透明不着色，凡着色细胞均为不健康者。计算四角大方格内的细胞数；压中线者只计算左线和上线者，右线和下线不计算在内(即仅计算压两个边的细胞)。
　　5.  接种培养
　　通过计数测知悬液中细胞数后，可根据实验所需细胞数量向培养容器中接种。细胞接种数量随实验目的、血清含量和细胞生物性状而定；一般接种量在1~10×105细胞/毫升范围，实验周期短，希望细胞增殖较快时，接种量可大些。用含血清量大的培养液培养胚胎来源细胞、无限细胞系和恶性细胞系时，细胞接种数量不宜太大。