使用 ProteOrange 进行蛋白质凝胶染色

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使用 ProteOrange 进行蛋白质凝胶染色

ProteOrange 染料可以在聚丙烯酰胺凝胶中电泳后快速、轻松地可视化蛋白质。 ProteOrange 是一种二苯乙烯型荧光团，含有两性离子片段。在核酸、多糖和其他分子存在的情况下，蛋白质/十二烷基硫酸钠胶束 (SDS) 选择性地结合染料。 ProteOrange 可有效对分子量为 6 kDa 及以上的蛋白质进行染色。在三个数量级覆盖的浓度范围内，荧光信号与蛋白质浓度呈线性关系。

ProteOrange 凝胶染色的灵敏度大约是考马斯染色的十倍，但不如银染色敏感。对于 ProteOrange，检测限为每条带 3 ng 蛋白质（考马斯的检测限约为 30 ng，银染的检测限约为 0.5 ng）。然而，与银染相比，ProteOrange 染色的方案要简单得多，因为它不需要洗涤，也不需要标准 SDS-PAGE 的固定。实验流程需要 30-60 分钟才能完成，包括在含有染料的 7.5% 乙酸水溶液中孵育凝胶，以及用 7.5% 乙酸短暂冲洗凝胶 30 秒。应使用波长为 312-365 nm 的透射仪进行可视化。 ProteOrange 库存溶液在室温下避光保存。

协议

  1. 确保染料原液不含沉淀物。如果不是这种情况，请将试剂在 70 °C 下保持几分钟，直至沉淀物全溶解，然后摇动小瓶。

  2. 准备染料的工作溶液。准备的量取决于凝胶块的大小和托盘尺寸。例如，25 mL 的溶液足以制备 10 × 15 cm 的凝胶片。要制备此溶液，请将 1.88 mL 冰醋酸溶解在 23 mL 水中，制成 7.5% 乙酸，并添加 5 μl 5000x ProteOrange 溶液。搅拌均匀，避光保存不超过三小时。

  3. 电泳结束后，将凝胶放入托盘中，加入染料工作液，避光孵育20-60分钟（对于较薄的凝胶或较低百分比的凝胶，应缩短时间；对于1 mm的凝胶，60分钟最佳厚，15% 凝胶）。染料的工作溶液只能使用一次，因为重复使用会导致灵敏度降低。

  4. 用 7.5% 乙酸溶液（不含染料）冲洗凝胶 30 秒。凝胶已准备好进行可视化。

  5. 为了可视化，将凝胶放在透照仪上。

  6. 要去除染料，请将凝胶在 0.1% Tween 20 溶液中孵育 10-12 小时，或用 7.5% 乙酸溶液反复清洗。

笔记

  • 为了提高灵敏度，我们建议在 TGB 缓冲液中添加 0.05% SDS（相对于标准 0.1%）进行电泳。 SDS 浓度的这种变化不会影响蛋白质的迁移率，但会缩短染色时间。

  • 在含有甲醇/乙醇的溶液中染色之前不要固定凝胶。

  • 对于小蛋白质或低百分比凝胶，应选 10% 乙酸溶液。

  • 该染料不适用于将蛋白质转移到膜上后对其进行染色。

  • 如果凝胶用于蛋白质印迹，ProteOrange 染色可以在标准转运缓冲液中进行，但这会导致灵敏度下降。

  • 对于 Triton X-100 凝胶电泳，电泳完成后立即在 Triton X100 不含 TGB 缓冲液中清洗凝胶（3×20 分钟），然后不久将凝胶在添加了 0.05% SDS 的 TGB 缓冲液中孵育 30 分钟，然后进行染色。

  • 为了在电泳过程中对蛋白质进行染色，ProteOrange 应溶解在上层（阴极）缓冲液中。电泳结束后，将凝胶在 7.5% 乙酸溶液中孵育 30 分钟，以降低荧光背景水平。

  • 无需 SDS 即可对凝胶进行染色，但该方法的灵敏度会降低，并且灵敏度很大程度上取决于蛋白质的氨基酸组成。除非电泳后应回收天然蛋白质，否则凝胶应在含有 0.05% SDS 的缓冲液中孵育，并根据标准方案进行染色。

  • 通常，预染色的蛋白梯用 ProteOrange 进一步染色时不会发出荧光。仅使用未染色的梯子。

  • 用 ProteOrange、考马斯染色或银染色后仍然可以进行。