流式细胞分析方案主要步骤以及流式免疫检测

流式细胞分析方案主要分为4个步骤：  

• 样品制备：应通过机械分离方法或化学解离技术制备单细胞悬液，如采用酶溶液或钙螯合试剂。

• 封闭：通常采用抗Fc抗体稀释液悬浮细胞，防止一抗非特异性结合。

• 抗体孵育：流式细胞分析的孵育步骤涉及多种组分，包括一抗、二抗、链霉亲和素和荧光染料。

• 数据采集：大多数流式细胞仪都配备获取和转化细胞特征信号必需的软件。用户可根据自身实验要求设定具体的软件参数。

适当的对照

除了目标细胞之外，每次进行流式细胞实验还应包含以下对照：

• 至少一份未染色样品，与试样同时进行每一步的缓冲液孵育，以优化实验的流速和电压。

• 一份适当的阴性对照样品，与试样基本相同，但用在一抗的宿主种属中生产的同型对照替代试样中的一抗。该对照用于非特异性结合二抗。

• 如有需要也可准备一份已知表达所有目标抗原的细胞组成的阳性对照，并与试样共同孵育，但仅用单色检测。

流式免疫检测

同其他免疫检测应用一样，流式细胞分析也可通过多种方法利用抗体探测特定的细胞基元。两大常用方法为：直接检测法和间接检测法。

直接检测法

直接检测法是一种一步染色工艺，通过一抗特异性结合目标抗原，可直接结合支持成像或其他结合状态检测的分子。探测位于细胞表面的抗原时，不建议固定细胞，否则可能导致抗体探针无法接触目标抗原。因此，在数据采集结束前保持细胞活力十分重要。如要查找直接检测法的抗体，可采用Antibody Explorer抗体搜索工具，将Search Within（搜索范围）设为“Primary Antibodies Only”（仅限一抗），application（应用）选择“flow cytometry”（流式细胞分析）。

间接检测法

间接检测法先用纯化抗体与目标抗原孵育结合，再用荧光染料标记的二抗（特异性靶向一抗宿主同型）与一抗特异性结合，形成一抗-荧光二抗复合物。采用纯化一抗搭配各种波长（或颜色）的荧光染料标记二抗（特异性针对生产一抗的宿主同型）可提升抗体库的模块化程度。

人β淀粉样蛋白1-42（aβ1-42）酶联免疫检测试剂盒介绍

用    途：用于人血清、血浆及相关液体样本中褪黑素 (Aβ1-42)测定。

工作原理

本试剂盒采用的是生物素双抗体夹心酶联免疫吸附法（ELISA）测定样品中人褪黑素 (Aβ1-42)水平。向预先包被了人褪黑素 (Aβ1-42)单克隆抗体的酶标孔中加入人褪黑素 (Aβ1-42)，温育；温育后，加入生物素标记的抗褪黑素 (Aβ1-42)抗体。再与链霉亲和素-HRP结合，形成免疫复合物，再经过温育和洗涤，去除未结合的酶，然后加入底物A、B，产生蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅与样品中人褪黑素 (Aβ1-42)的浓度呈正相关。

试剂盒组成

需要而未提供的试剂和器材

1． 37℃恒温箱。

2． 标准规格酶标仪。

3． 精密移液器及一次性吸头

4． 蒸馏水，

5． 一次性试管

6． 吸水纸

注意事项

1． 从2-8℃取出的试剂盒，在开启试剂盒之前要室温平衡至少30分钟。酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。

2． 各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差

3． 严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准.

4． 为避免交叉污染，要避免重复使用手中的吸头和封板膜。

5． 不用的其它试剂应包装好或盖好。不同批号的试剂不要混用。保质前使用。

6． 底物B对光敏感，避免长时间暴露于光下。

洗板方法

手工洗板方法：甩掉酶标板内的液体；在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次；将稀释后的洗涤液至少0.35ml注入孔内，浸泡1-2分钟。根据需要，重复此过程数次。

自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中

标本要求

1．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。

2．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融。

操作程序

1. 标准品的稀释：(本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀释。)

2. 根据代测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。每个标准品和空白孔建议做复孔。每个样品根据自己的数量来定，能使用复孔的尽量做复孔。

3. 加样：1）空白孔，空白对照孔不加样品，生物素标记的抗褪黑素 (Aβ1-42)抗体，链霉亲和素-HRP，只加显色剂A&B和终止液，其余各步操作相同；2）标准品孔：加入标准品50ul，链霉亲和素-HRP50ul(标准品中已事先整合好生物素抗体，故不加)；3）代测样品孔：加入样本40ul，然后各加入抗褪黑素 (Aβ1-42)抗体10ul、链霉亲和素-HRP50ul，盖上封板膜，轻轻震荡混匀，37℃温育60分钟。

4. 配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用。

5. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

6. 显色：每孔先加入显色剂A50ul，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟.

7. 终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。

8. 测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。 测定应在加终止液后10分钟以内进行。

9. 根据标准品的浓度及对应的OD值计算出标准曲线的直线回归方程，再根据样品的OD值在回归方程上计算出对应的样品浓度。也可以使用各种应用软件来计算。

操作程序总结：

1.准备试剂，样品和标准品

2.加入准备好的样品和标准品，生物素标记的二抗和酶标试剂，37℃反应60分钟

3.洗板5次，加入显色液A、B，37℃显色15分钟

4.加入终止液

5.10分钟内读OD值

6.计算

检测范围：100 pg/ml→3200 pg/ml。

保存：2-8℃。

有效期：6个月(2-8℃)。

大鼠γ谷氨酰转肽酶(GGT)酶联免疫检测试剂盒介绍

用    途：用于大鼠血清、血浆及相关液体样本中γ谷氨酰转肽酶(GGT)测定。

工作原理

本试剂盒采用的是生物素双抗体夹心酶联免疫吸附法（ELISA）测定样品中大鼠γ谷氨酰转肽酶(GGT)水平。向预先包被了大鼠γ谷氨酰转肽酶(GGT)单克隆抗体的酶标孔中加入大鼠γ谷氨酰转肽酶(GGT)，温育；温育后，加入生物素标记的抗γ谷氨酰转肽酶(GGT)抗体。再与链霉亲和素-HRP结合，形成免疫复合物，再经过温育和洗涤，去除未结合的酶，然后加入底物A、B，产生蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅与样品中大鼠γ谷氨酰转肽酶(GGT)的浓度呈正相关。

试剂盒组成

需要而未提供的试剂和器材

1． 37℃恒温箱。

2． 标准规格酶标仪。

3． 精密移液器及一次性吸头

4． 蒸馏水，

5． 一次性试管

6． 吸水纸

注意事项

1． 从2-8℃取出的试剂盒，在开启试剂盒之前要室温平衡至少30分钟。酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。

2． 各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差

3． 严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准.

4． 为避免交叉污染，要避免重复使用手中的吸头和封板膜。

5． 不用的其它试剂应包装好或盖好。不同批号的试剂不要混用。保质前使用。

6． 底物B对光敏感，避免长时间暴露于光下。

洗板方法

手工洗板方法：甩掉酶标板内的液体；在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次；将稀释后的洗涤液至少0.35ml注入孔内，浸泡1-2分钟。根据需要，重复此过程数次。

自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中

标本要求

1．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。

2．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融。

操作程序

1. 标准品的稀释：(本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀释。)

2. 根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。每个标准品和空白孔建议做复孔。每个样品根据自己的数量来定，能使用复孔的尽量做复孔。

3. 加样：1）空白孔，空白对照孔不加样品，生物素标记的抗GGT抗体，链霉亲和素-HRP，只加显色剂A&B和终止液，其余各步操作相同；2）标准品孔：加入标准品50ul，链霉亲和素-HRP50ul(标准品中已事先整合好生物素抗体，故不加)；3）待测样品孔：加入样本40ul，然后各加入抗GGT抗体10ul、链霉亲和素-HRP50ul，盖上封板膜，轻轻震荡混匀，37℃温育60分钟。

4. 配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用。

5. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

6. 显色：每孔先加入显色剂A50ul，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟.

7. 终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。

8. 测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。 测定应在加终止液后10分钟以内进行。

9. 根据标准品的浓度及对应的OD值计算出标准曲线的直线回归方程，再根据样品的OD值在回归方程上计算出对应的样品浓度。也可以使用各种应用软件来计算。

操作程序总结：

1.准备试剂，样品和标准品

2.加入准备好的样品和标准品，生物素标记的二抗和酶标试剂，37℃反应60分钟

3.洗板5次，加入显色液A、B，37℃显色15分钟

4.加入终止液

5.10分钟内读OD值

6.计算

试剂盒性能：

1.样品线性回归与预期浓度相关系数R值为0.92以上。

2.批内与批间应分别小于9%和15%

检测范围：

检测范围：10 ng/L -450 ng/L

保存条件及有效期：

保存：2-8℃。

有效期：6个月(2-8℃)。