样品实验方案
简要概述
- 用PBS洗涤细胞
- 加入2 mL隔离缓冲液
- 在冰上孵育10分钟
- 使用均质器均质化细胞或添加试剂A。
- 7000g离心10分钟
- 去除上清液(细胞质部分)
- 将沉淀重悬于隔离缓冲液中
- 7000g离心10分钟
- 将沉淀重悬于测定缓冲液(线粒体级分)中
实验步骤
1.用冷PBS洗涤细胞一次。 对于悬浮的细胞,请通过离心收集细胞。
2.向细胞中加入2 mL分离缓冲液(组分A),并在冰上孵育10分钟。
3.可以通过两种方式提取细胞质。
①:将40 µL试剂A(组分B)加入混合物中,涡旋并在冰上孵育10分钟。
②:使用Dounce组织研磨机匀浆4-5次,使细胞匀浆。
4.在4°C下以600 g离心10分钟,收集上清液,在4°C下以7,000 g离心10分钟。 上清是细胞质部分。
5.将沉淀重悬于1 mL分离缓冲液(组分A)中,并在4°C下以7,000 g离心10分钟。
6.丢弃上清液,并根据下游应用将沉淀重悬在适当的测定缓冲液中。
7.蛋白质浓度可以通过Amplite 荧光荧光胺蛋白质定量试剂盒(Cat#11100)进行定量。
图示
图1.使用ReadiPrep 线粒体/细胞质分离试剂盒收集HeLa细胞的线粒体组分。 通过Amplite 荧光荧光胺蛋白质定量试剂盒(#11100)对蛋白质进行定量。 在有或没有MitoLite Green(#22675)的情况下孵育100 µg线粒体片段,并用NovoCyte 3000流式细胞仪进行测定。
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参考文献
Studied by Rapid Fractionation of Barley (Hordeum vulgare) Protoplasts
Authors: Gardestrom, P.; Wigge, B., Influence of Photorespiration on ATP/ADP Ratios in the Chloroplasts, Mitochondria, and Cytosol
Journal: Plant Physiol (1988): 69-76
and mitochondria
Authors: Lilley, R. M.; Stitt, M.; Mader, G.; Heldt, H. W., Rapid fractionation of wheat leaf protoplasts using membrane filtration : the determination of metabolite levels in the chloroplasts, cytosol
Journal: Plant Physiol (1982): 965-70