肽标记策略
肽标记策略
标记肽可以通过修饰分离的肽或在固相合成过程中结合标记来制备。用荧光团标记肽的常用策略包括:
肽合成过程中的标记-可以耐受解封闭程序的染料可以结合到肽链的氨基末端。
2.N端修饰:N端是指蛋白质或多肽链起始处的游离胺基（-NH2）。可以使用胺反应性琥珀酰亚胺酯荧光团对其进行共翻译修饰或翻译后修饰。
3.赖氨酸残基:赖氨酸残基的ε-氨基可以用胺反应性琥珀酰亚胺酯荧光团修饰。
4.C端修饰:C端是指蛋白质或多肽链末端的羧基（-COOH）。它可以在翻译后进行修饰，通常是在C端酰胺化之后。
5.如果肽链上有半胱氨酸，巯基反应蛋白标记可以共价标记合成肽。
6.非天然氨基酸可以在合成过程中结合到肽链中，然后通过生物正交反应（例如基于叠氮化物和炔烃的反应以及酮醛反应）用染料或其他探针标记。
抗体验证的优越策略：封闭肽验证
据报道，每年因劣质抗体造成的生物和医学研究损失约为8亿美元。此外，实验结果不一致和抗体重复性差的后果 是无法估计的。
国际抗体验证工作组（IWGAV）于2016年9月发表题为《 自然方法 中 抗体验证的建议》的文章 ，强调抗体验证应根据目标蛋白的相应应用和背景进行。作者提出了抗体验证的五个概念支柱：（i）遗传策略，（ii）正交策略，（iii）独立抗体策略，（iv）标记蛋白的表达，以及（v）免疫捕获后进行质谱分析。多发性硬化症）。
这五种方法各有其优缺点以及适用条件。例如，遗传策略通过比较细胞或组织中的相关信号来评估抗体特异性，其中使用 CRISPR-Cas9 或 RNA 干扰 (RNAi) 敲除或敲低目标基因与野生型 (WT) 对照的信号。尽管这种方法很简单，但未能击倒或敲除目标基因将大大损害该方法的实验可行性。
免疫捕获后进行质谱 (MS) 的方法可以识别与纯化抗体直接相互作用的蛋白质， 以及与目标蛋白质间接相互作用的其他蛋白质。 然而，这种方法依赖于昂贵的科学仪器和实验材料。并非每个实验室都能负担得起这些设备。
在 Affinity Biotech，抗体通过 独立抗体验证进行验证。为此，使用几种抗体来识别靶蛋白上的不同表位。具有最高特异性的抗体是通过包括比较和定量分析的适当程序确定的。虽然大多数抗体的检测应该没有问题，但对于检测特异性要求较高的抗体，特别是那些位点特异性的磷酸化抗体，仍然不够。
结合多年的抗体研发和生产经验，Affinity Biotech采用了更合适的抗体验证策略： 封闭 肽验证。
封闭肽(抗原)与抗体一一对应。 。这是最原始的材料，只有原厂才能提供。
首先，我们对封闭肽进行 MS 分析，以确保肽序列准确。
在蛋白质印迹分析中，肽会阻断目标抗体的信号。没有封闭肽的泳道用作对照。封闭肽将与靶蛋白竞争结合位点，从而在封闭基团中不留下特异性条带。
该策略目前用于验证我们的抗体。它对于磷抗体的生产至关重要，因为它确保了磷抗体的位点特异性。换句话说，磷酸化抗体只能识别相应位点的磷酸化靶蛋白。非磷酸化的目标蛋白或其他位点磷酸化的目标蛋白将不会被识别。
举个例子。在 Phospho-MSK1 (Ser211) Antibody（货号 AF7155）的蛋白质印迹验证中，泳道 1 和泳道 3 中分别添加了非磷酸化阻断肽和磷酸化阻断肽。 2号车道没有被封闭。结果显示，使用磷酸化肽封闭目标蛋白后，没有检测到目的条带。
代谢组学数据的统计分析方法和策略
获得代谢组学数据后，需要利用软件读取并分析原始数据的信息，以确定原始数据中所含代谢成分的组成和含量。有许多统计软件可以读取和分析核磁共振谱和质谱数据。 XCMS 是一款常用的免费软件，用于读取和分析质谱原始数据。类似的常用软件还有MZmine2、MetAlign、MathDAMP、LCMStats等。
一旦获得代谢物组成和含量，就可以对这些数据进行统计分析。常用的分析方法包括主成分分析(PCA)、偏最小二乘回归、聚类分析、差异表达分析等。结果还可以利用上述数据库进行功能和通路富集分析。
小动物的机械通气策略
许多临床前或基础研究需要对小型实验动物进行长期机械通气，如果没有合适的呼吸机，这可能具有挑战性。 CWE有一个解决方案，我们的SAR-1000高级小动物呼吸机。
虽然正压通气的原理很简单，但通常证明很难在不引起呼吸机引起的肺损伤（VILI）和伴随的生理状态退化的情况下维持小动物（尤其是小鼠）超过几个小时。此处的评论提供了一些指南，以在长时间使用呼吸机期间成功保持动物健康。这些建议主要针对小鼠，但适用于所有小型实验室哺乳动物。
CWE的SAR-1000小动物呼吸机专门设计用于在长期和短期手术中安全有效地支持小鼠和其他小动物，使用最近研究中指出的两个关键策略1.
1. 低潮气量（VT）定期呼吸或肺复张动作（RM）的通气。
2. 呼气末正压 （PEEP）。
下面详细介绍了这两种重要技术。
低电压T 通气涉及使用 VT 在8毫升/千克左右，而不是常用的10-12毫升/千克。这本身会导致通气不足导致的最终呼吸衰竭，但当辅以周期性叹息或 RM 时，可以避免肺不张并发生肺泡复张。该方案保持良好的气体交换，不会促进伤害。来自文献1,2，最佳RM频率约为12小时-1，或每五分钟一次，在 P爪子 （气道峰值压力）为 30cmH2O.
第二个关键是使用PEEP。结合上述策略，PEEP 约为 6cmH2O证明是维持下叶通畅和避免局部肺不张的选择1,3. 下面链接了如何将 PEEP 与 SAR-1000 呼吸机配合使用的图表。
评论：30厘米高2O RM 压力不是一个任意值，对于鼠标来说可能看起来很高。这已被实验确定可以增加肺顺应性，并且被认为可以重新打开塌陷的肺泡，或者可能招募具有临界开放经呼吸压的二次肺泡群体。 无论如何，较低的P爪子 压力在保持良好的血气同时避免VILI方面几乎不那么有效。
综上所述，低V的策略T 通气、定期大容量 RM 呼吸和 PEEP 应有助于在通气期间保持小动物的健康。应适当设置呼吸频率 （RR） 以提供正常的分钟通气量 （MV），同时考虑到降低的 VT 加上周期性高 VT RM呼吸。这个故事还有很多，包括炎症或病理变化对肺力学的作用等。虽然正压通气本质上是一种不自然的操作，但通过研究自主呼吸动物的模式可以学到很多东西。例如，上面讨论的五分钟RM间隔可以随机化，以更好地模仿自然模式并产生更好的结果。2.
CWE Inc. 的 SAR-1000 呼吸机通过其内置的自动 SIGH 功能和简单的 PEEP 连接，以及 SAR-Comm 软件中包含的远程控制和其他功能，支持上述通气策略。 SAR-1000可让您安全轻松地延长手术时间，以产生更好的结果和更健康的结果。