常见蛋白质印迹问题的提示和技巧
蛋白质印迹是研究实验室普遍使用的一种技术，用于研究感兴趣的蛋白质。蛋白质印迹用于抗体验证、蛋白质-蛋白质相互作用研究以及许多其他应用。1然而，生成可解释的蛋白质印迹结果可能具有挑战性。以下是一些常见问题以及解决方法。
高背景
| 可能是由于 | 尝试这个 |
|---|---|
| 高抗体浓度 | 使用一抗和二抗进行滴定。包括已知的蛋白质对照。 |
| 封闭液 | 使用新鲜的封闭液，增加封闭时间/温度，尝试不同的封闭剂。 |
| 印迹在封闭/洗涤过程中干燥 | 确保膜在封闭和清洗步骤中被充分覆盖。 |
| 洗得不够 | 增加洗涤次数和洗涤液体积。确保至少洗涤 3 次，每次 5 分钟。 |
| 胶片曝光过度 | 尝试较短的曝光时间。 |
没信号
| 可能是由于 | 尝试这个 |
|---|---|
| 抗体浓度太低 | 使用一抗和二抗进行滴定。包括已知的蛋白质对照。 |
| 样品中目标含量低 | 增加凝胶上的蛋白质浓度。建议滴定。 |
| 一抗和二抗不匹配 | 确保二抗针对一抗的宿主物种。 |
| 转移问题 | 使用带有颜色的蛋白质标记来检查转移。使用对照蛋白优化转移。转移前检查是否有气泡。 |
| 洗次数太多 | 减少洗涤次数。 |
多频段
| 可能是由于 | 尝试这个 |
|---|---|
| 凝胶超载 | 滴定加载在凝胶上的蛋白质样品。 |
| 使用过多抗体 | 使用一抗和二抗进行滴定。包括已知的蛋白质对照。 |
| 胶片曝光过度 | 尝试较短的曝光时间。 |
| 阻塞问题 | 使用新鲜的封闭液，增加封闭时间/温度，尝试不同的封闭剂。 |
| 目标蛋白的翻译后修饰 | 研究发表了目标蛋白翻译后修饰的例子，可以提供生物学解释（即磷酸化、糖基化、核糖基化）。 |
| 翻译后裂解 | 许多蛋白质被合成为前蛋白质，然后被切割成活性形式，例如前半胱天冬酶。研究针对您的目标发布的示例。 |
| 拼接变体 | 选择性剪接可能会产生由同一基因产生的不同大小的蛋白质。研究针对您的目标发布的示例。 |