磷酸化 NF-κB p65 (Ser536) (93H1) 兔单克隆抗体产品信息

反应性HMR Hm Mk Pg

灵敏度内源性

分子量（kDa）65

来源/同种型兔免疫球蛋白G

产品使用信息

应用稀释

蛋白质印迹法1：1000

Simple Western™1:10 – 1:50

免疫沉淀1:50

免疫荧光（免疫细胞化学）1:800 – 1:3200

流式细胞仪（固定/透化）1:800 – 1:3200

贮存 含有 10 mM HEPES 钠 (pH 7.5)、150 mM NaCl、100 µg/ml BSA、50% 甘油和低于 0.02% 叠氮化na。储存于 –20°C。不要等分抗体。

蛋白质印迹实验方案 对于蛋白质印迹，将膜与稀释的一抗在 5% w/v BSA、1X TBS、0.1% Tween ® 20 中一起在 4°C 下孵育过夜，并轻轻摇动。  注意：请参阅一抗产品网页了解推荐的抗体稀释度。

A. 溶液和试剂 从样品制备到检测，您的蛋白质印迹所需的试剂现在都在一个方便的套件中：#12957蛋白质印迹应用解决方案套件  注：用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。  

20X 磷酸盐缓冲盐水 (PBS)：( #9808 ) 要制备 1 L 1X PBS：将 50 ml 20X PBS 添加到 950 ml dH 2 O 中，混合。

10X Tris 缓冲盐水 (TBS)：( #12498 ) 要制备 1 L 1X TBS：将 100 ml 10X 添加到 900 ml dH 2 O 中，混合。

1X SDS 样品缓冲液：蓝色上样包 ( #7722 ) 或红色上样包 ( #7723 ) 通过将 1/10 体积的 30X DTT 添加到 1 体积的 3X SDS 上样缓冲液中来制备新鲜的 3X 还原性上样缓冲液。用 dH 2 O稀释至 1X。

10X Tris-Glycine SDS 电泳缓冲液：( #4050 ) 要制备 1 L 1X 电泳缓冲液：将 100 ml 10X 电泳缓冲液添加到 900 ml dH 2 O 中，混合。

10X Tris-甘氨酸转移缓冲液：( #12539 ) 要制备 1 L 1X 转移缓冲液：将 100 ml 10X 转移缓冲液添加到 200 ml 甲醇 + 700 ml dH 2 O 中，混合。

10X Tris 缓冲盐水与 Tween ® 20 (TBST)：( #9997 ) 要制备 1 L 1X TBST：将 100 ml 10X TBST 添加到 900 ml dH 2 O 中，混合。

脱脂奶粉：（#9999）。

封闭缓冲液：1X TBST，含 5% w/v 脱脂奶粉；对于 150 毫升，将 7.5 克脱脂奶粉添加到 150 毫升 1X TBST 中并充分混合。

洗涤缓冲液：( #9997 ) 1X TBST。

牛血清白蛋白 (BSA)：( #9998 )。

一抗稀释缓冲液：1X TBST，含 5% BSA；对于 20 ml，将 1.0 g BSA 添加到 20 ml 1X TBST 中并充分混合。

生物素化蛋白梯检测包：( #7727 )。

蓝色预染蛋白质标记物，宽范围 (11-250 kDa)：( #59329 )。

印迹膜和纸：( #12369 ) 该方案已针对硝酸纤维素膜进行了优化。通常建议孔径为 0.2 µm。

与 HRP 缀合的二抗：抗兔 IgG、HRP 连接抗体 ( #7074 )。

检测试剂：SignalFire™ ECL 试剂 ( #6883 )。

B. 蛋白质印迹 样品制备的通用方案。

通过添加含有调节剂的新鲜培养基来处理细胞所需的时间。

从文化中吸取介质；用 1X PBS 清洗细胞；吸出。

添加 1X SDS 样品缓冲液（6 孔板每孔 100 µl，10 cm 直径板每孔 500 µl）裂解细胞。立即从板上刮下细胞并将提取物转移至微量离心管中。保持在冰上。

超声处理 10–15 秒以完成细胞裂解并剪切 DNA（以降低样品粘度）。

将 20 µl 样品加热至 95–100°C 5 分钟；在冰上冷却。

微量离心 5 分钟。

将 20 µl 上样到 SDS-PAGE 凝胶 (10 cm x 10 cm) 上。  

注：建议加载预染色分子量标记（#59329，10 µl/泳道）以验证

电转移和生物素化蛋白质梯（#7727，10 µl/泳道）以确定分子量。  

电转移至硝酸纤维素膜 ( #12369 )。

C. 膜封闭和抗体孵育

注：体积适用于 10 cm x 10 cm (100 cm 2 ) 的膜；对于不同尺寸的膜，相应地调整体积。  

I. 膜封闭

（可选）转膜后，用 25 ml TBS 室温清洗硝酸纤维素膜 5 分钟。

将膜在 25 ml 封闭缓冲液中室温孵育 1 小时。

用 15 ml TBST 洗涤 3 次，每次 5 分钟。

二.一抗孵育

将膜和一抗（按照产品网页中推荐的适当稀释度和稀释剂）在 10 ml 一抗稀释缓冲液中孵育，并在 4°C 下轻轻搅拌过夜。

用 15 ml TBST 洗涤 3 次，每次 5 分钟。

将膜与抗兔 IgG、HRP 连接抗体 ( #7074 at 1:2000) 和抗生物素、HRP 连接抗体 ( #7075 at 1:1000–1:3000) 一起孵育，以检测 10 ml 溶液中的生物素化蛋白质标记物室温下轻轻搅拌封闭缓冲液 1 小时。

用 15 ml TBST 洗涤 3 次，每次 5 分钟。 继续检测（D 部分）。

D. 蛋白质检测

使用指南：

在 TBST 中洗涤膜结合的 HRP（抗体偶联物） 3 次，每次 5 分钟。

通过稀释一份 2X 试剂 A 和一份 2X 试剂 B（例如，对于 10 ml，添加 5 ml 试剂 A 和 5 ml 试剂 B）来制备 1X SignalFire™ ECL 试剂 ( #6883 )。搅拌均匀。

将基质与膜一起孵育 1 分钟，除去多余的溶液（膜保持湿润），用塑料包裹并暴露于 X 射线胶片。

* 避免反复接触皮肤。