Amplite NAD+/NADH检测试剂盒（比色法）是AAT Bioquest研发的检测NAD+/NADH的试剂盒。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD +）和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP +）是细胞中发现的两种重要的辅因子。 NADH是NAD +的还原形式，NAD +是NADH的氧化形式。 NAD形成NADP，通过酯键将磷酸基团添加到腺苷核苷酸的2’位置。 NADP用于合成代谢生物反应，例如脂肪酸和核酸合成，其需要NADPH作为还原剂。 在叶绿体中，NADP是在光合作用的初步反应中重要的氧化剂。 通过光合作用产生的NADPH用作卡尔文光合作用循环中生物合成反应的还原能力。

传统的NAD / NADH和NADP / NADPH测定通过监测340nm处NADH或NADPH吸收的变化来进行。 Amplite™荧光总NAD和NADH检测试剂盒为敏感检测NAD和NADH提供了一种便捷的方法。 系统中的酶特异性识别酶循环反应中的NAD / NADH，其显着提高了检测灵敏度。 此外，该测定具有非常低的背景，因为其在红色可见范围内运行，这显着降低了生物样品引起的干扰。金畔生物是AAT Bioquest的中国代理商，为您提供优质的Amplite NAD+/NADH检测试剂盒。 

Amplite 比色NAD / NADH检测试剂盒提供灵敏的一步法检测，可在100μL检测体积（300 nM;图1）中检测少至30皮摩尔的NAD（H）。 可以以方便的96孔或384孔板进行检测。 其信号可通过光吸收酶标仪在~575nm或~570nm至~605nm的吸光度比下轻松读取，以提高测定灵敏度。

适用仪器

96孔板测定示例

概述

准备NAD / NADH反应混合物（50μL）

添加NADH标准品或测试样品（50μL）

在室温下孵育15分钟–2小时

检测Ex / Em = 540 / 590nm处的荧光强度

操作方法

1.准备NADH储备溶液：

将200μLPBS缓冲液加入到NADH标准品（组分C）的小瓶中，得到1mM（1nmol / L）NADH储备溶液。

注意：未使用的NADH储备溶液应分成单次使用的等分试样并储存在-20℃。

2.准备NAD / NADH反应混合物：

将10mL NAD / NADH缓冲液（组分B）加入NAD / NADH再循环酶混合物（组分A）的瓶中，并充分混合。

注意：NAD / NADH反应混合物足以用于两个96孔板。 未使用的NAD / NADH反应混合物应分成一次性等分试样并储存在-20℃。

3.准备NADH标准品的系列稀释液（0至10μM）：

3.1将10μL的NADH储备溶液（来自步骤1）加入到990L PBS缓冲液（pH 7.4）中，以产生10μM（10pmol / L）NADH标准溶液。

注意：稀释的NADH标准溶液不稳定，应在4小时内使用。

3.2取200μL 10μM NADH标准溶液进行1：3连续稀释，得到NADH标准品的3,1,0.3,0.1,0.03,0.01和0μM连续稀释液。

3.3如表1和2中所述，将含有NADH标准品和含NAD / NADH的测试样品的系列稀释液加入到黑色96孔板中。

注意：根据需要准备细胞或组织样本。

表1黑色96孔板中NADH标准品和测试样品的布局

注意：NS = NADH标准，BL =空白对照，TS =测试样品。

表2.每个孔的试剂组成

注意：将连续稀释的NADH标准品（0.01μM至10μM）加入NS1至NS7的孔中，一式两份。 高浓度的NADH（例如，>100μM，终浓度）可能由于NADH探针（对非荧光产物）的过度氧化而导致荧光信号降低。

4.在上清液反应中运行NAD / NADH测定：

4.1将50μL的NADH反应混合物（来自步骤2）加入NADH标准品，空白对照和测试样品（来自步骤3.3）的每个孔中，使得总NADH测定体积为100μL/孔。

注意：对于384孔板，每孔加入25μL样品和25μLNADH反应混合物。

4.2在室温下孵育反应15分钟至2小时，避光。

4.3用Ex / Em = 540 / 590nm的荧光酶标仪检测荧光。

注1：也可将板的混合物转移到白色透明底板上，用吸光度酶标仪在576±5nm波长下读数。 与荧光读数相比，吸收检测具有较低的灵敏度。

注意2：对于NAD / NADH比率测量，建议使用试剂盒15263。

注意3：对于细胞的NAD / NADH检测，建议使用ReadiUse 哺乳动物细胞裂解缓冲液* 5X *（货号：20012）裂解细胞。

数据分析

        空白孔中的荧光（仅用PBS缓冲液）用作对照，并从具有NADH反应的那些孔的值中减去。 NADH标准曲线如图1所示。

注意：荧光背景随时间增加，因此减去每个数据点的空白孔的荧光强度值是很重要的。

图1.使用NOVOStar酶标仪（BMG Labtech），在黑色96孔板中用Amplite 总NAD和NADH测定试剂盒测量NADH剂量反应。 在孵育1小时（n = 3）时可以检测到低至100nM（10pmol /孔）的NADH，而NADPH没有响应。

试剂应用文献

AMPK activation protects cells from oxidative stress-induced senescence via autophagic flux restoration and intracellular NAD+ elevation
Authors: Han, Xiaojuan and Tai, Haoran and Wang, Xiaobo and Wang, Zhe and Zhou, Jiao and Wei, Xiawei and Ding, Yi and Gong, Hui and Mo, Chunfen and Zhang, Jie and others
Journal: Aging cell (2016): 416–427

参考文献

Reduction of renal tubular injury with a RAGE inhibitor FPS-ZM1, valsartan and their combination in streptozotocin-induced diabetes in the rat
Authors: Davoud Sanajou, Amir Ghorbani Haghjo, Hassan Argani, Leila Roshangar, Nadereh Rashtchizadeh, Saeed Nazari Soltan Ahmad, Zahra Ashrafi-Jigheh, Saman Bahrambeigi, Farshid Asiaee, Jalil Rashedi
Journal: European journal of pharmacology (2019): 40–48

Functional analysis of the mitochondrial alternative oxidase gene (aox1) from Aspergillus niger CGMCC 10142 and its effects on citric acid production
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Journal: Applied microbiology and biotechnology (2018): 1–15

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Journal: Fermentation (2017): 61

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Authors: Min Ling, Peixin Huang, Shamima Islam, Daniel P Heruth, Xuanan Li, Li Qin Zhang, Ding-You Li, Zhaohui Hu, Shui Qing Ye
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Journal: Oncogene (2017)

Metabolic and molecular insights into an essential role of nicotinamide phosphoribosyltransferase
Authors: Li Q Zhang, Leon Van Haandel, Min Xiong, Peixin Huang, Daniel P Heruth, Charlie Bi, Roger Gaedigk, Xun Jiang, Ding-You Li, Gerald Wyckoff
Journal: Cell Death & Disease (2017): e2705

Pyrroloquinoline Quinone, a Redox-active o-Quinone, Stimulates Mitochondrial Biogenesis by Activating SIRT1/PGC-1α Signaling Pathway
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Journal: Biochemistry (2017)

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Journal: Journal of Biological Chemistry (2016): 7621–7636

相关产品

Amplite NAD/NADH比率检测试剂盒（比色法）是美国AAT Bioquest研发的检测NAD/NADH的试剂盒，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP）是细胞中发现的两种重要的辅酶。 NAD形成NADP，通过酯键将磷酸基团添加到腺苷核苷酸的2’位置。 NADH（NADPH）是NAD（NADP）的还原形式，NAD（NADP）是NADH（NADPH）的氧化形式。 NAD或NADP在氧化还原反应中起辅助因子的作用，在细胞反应中转移电子。 氧化形式和还原形式之间的平衡是NAD / NADH（NADP / NADPH）比率。 该比率是指示细胞氧化还原状态的重要组分，并且它是反映代谢活性和细胞健康的测量。 在健康的哺乳动物组织中，游离NAD +和NADH之间的比率的估计可以高达700.相反，NADP / NADPH比率通常为约0.005，因此NADPH是该辅酶的主要形式。

该Amplite 比色NAD / NADH比率分析试剂盒提供了一种比色法，用于测量培养细胞中细胞内总NAD / NADH量和NAD / NADH比率。 在该测定中，裂解物中的NAD可以用NAD提取溶液提取并通过酶反应转化为NADH，然后通过NADH探针识别，在反应后得到黄色染料，其在460nm处具有吸光度。 产生的染料量与细胞裂解物中NAD或NADH的浓度成正比，可用作细胞NAD / NADH浓度的指示剂。金畔生物是AAT Bioquest的中国代理商，为您提供优质的NAD/NADH检测试剂盒。 

96孔板检测示例

概述

准备25μLNADH标准品和/或测试样品在室温下

加入25μLNAD提取液孵育15分钟

加入25μL中和溶液加入75μLNAD/ NADH反应混合物在

室温下孵育15分钟至2小时

监测 在460nm处的吸光度

注意：在开始实验之前，在室温下解冻每个试剂盒组分中的一个。

操作步骤

1.准备NADH储备溶液：

将200μLPBS缓冲液加入到NADH标准品（组分C）的小瓶中，得到1mM（1nmol / L）NADH储备溶液。

注意：未使用的NADH储备溶液应分成单次使用的等分试样并储存在-20℃。

2.准备NAD / NADH反应混合物：

2.1将8 mL NADH探针缓冲液（组分B-II）加入到NAD / NADH回收酶混合物（组分A）的瓶中，并充分混合。

2.2将2 mL NADH探针（组分B-I）加入上述瓶中（来自步骤2.1）并充分混合。

注意：这种NAD / NADH反应混合物足以进行125~200次分析。 未使用的NAD / NADH反应混合物应分成一次性等分试样并储存在-20℃。

3.准备连续稀释的NADH标准品（0至10μM）：

3.1将10μL1mMNADH储备溶液（来自步骤1）加入990L PBS缓冲液（pH7.4）中，得到10μM（10pmol / L）NADH标准溶液。

注意：稀释的NADH标准溶液不稳定，应在4小时内使用。

3.2取200μL10M NADH标准溶液（来自步骤3.1）进行1：2连续稀释，得到5,2.5,1.25,0.625,0.313,0.156,0.078和0 M系列稀释的NADH标准品。

4.运行总NAD / NADH分析（总共400个分析/试剂盒）：

4.1如表1和2中所述，将含有NADH标准品和含NAD / NADH的测试样品的系列稀释液加入白色/透明底96孔微孔板中。

注意：根据需要准备细胞或组织样本NAD / NADH裂解缓冲液（组分G）可用于裂解细胞（详见附录）。

表1.白色/透明底96孔微孔板中NADH标准品和测试样品的布局

注意：NS = NADH标准，BL =空白对照，TS =测试样品

表2.每个孔的试剂组成

*注意：将连续稀释的NADH标准品（0.078μM至5μM）加入NS1至NS7的孔中，一式两份。 高浓度的NADH（例如，>100μM，最终浓度）将导致饱和信号并使校准曲线非线性。

4.2将50μLNAD/ NADH反应混合物（来自步骤2.2）加入NADH标准品，空白对照和测试样品（来自步骤4.1）的每个孔中，以使总NAD / NADH测定体积为100μL/孔。

4.3在室温下孵育反应15分钟至2小时，避光。

4.4使用吸光度读板仪在460 nm处检测吸光度的增加。

5.运行NAD / NADH比率分析（总共250个分析/试剂盒）：

5.1如表3和4中所述，将连续稀释的NADH标准品和/或含NAD / NADH的测试样品加入白色/透明96孔微孔板中。

注意：根据需要准备细胞或组织样本。 为方便起见，裂解缓冲液（组分G）可用于裂解细胞（详见附录）。

表3.白色/透明96孔微孔板中NADH标准品和测试样品的布局

注意：NS = NAD / NADH标准; BL =空白对照; TS =测试样品; TS（NAD）=用NAD提取溶液（组分D）处理10至15分钟的测试样品，然后用中和溶液（组分E）中和。

表4.每个孔的试剂组合物

*注意：将连续稀释的NADH标准品（0.078μM至5μM）加入NS1至NS7的孔中，一式两份。 高浓度的NADH（例如，>100μM，最终浓度）将导致饱和信号并使校准曲线非线性。

5.2对于NAD提取（NAD量）：将25μLNAD提取溶液（组分D）加入含有NAD / NADH的测试样品的孔中。在室温下孵育10至15分钟，然后加入25μLNADH中和溶液（组分E）以中和NAD提取物，如表3和4中所述。

对于总NAD和NADH（总量）：将25μLNAD/ NADH对照溶液（组分F）加入NADH标准品和含有NAD / NADH的测试样品的孔中。在室温下孵育10至15分钟，然后如表3和4中所述添加25μL提取对照溶液（组分F）。

注意：根据需要准备细胞或组织样本。裂解缓冲液（组分G）可用于裂解细胞（详见附录）。

5.3将75μL的NADH反应混合物（来自步骤2.2）加入NADH标准品，空白对照和测试样品（NAD / NADH和NAD提取物）（来自步骤5.1）的每个孔中，使总NADH测定体积为150μL /好。

5.4在室温下孵育反应15分钟至2小时，避光。

5.5使用吸光度读板仪在460 nm处检测吸光度的增加。

数据分析

        空白孔（仅PBS缓冲液）中的吸光度用作对照，并从具有NADH反应的那些孔的值中减去。

图1. Amplite™比色NAD / NADH比率分析试剂盒用于使用SpectraMax酶标仪（Molecular devices）测量白色/透明96孔微孔板中的总NAD / NADH量和NAD / NADH比率。

A-总NADH和NAD剂量反应：孵育1小时可检测到低至0.1μM的总NADH。

B-NAD / NADH比：在有或没有NAD提取溶液的情况下处理等量的NAD和NADH混合物15分钟，然后在室温下用提取溶液中和。 在460nm读取信号。 基于图1B中所示的吸光度计算NAD / NADH摩尔比。

附录：使用组分D（裂解缓冲液）的测试样品制剂

1.植物细胞样品：用200mg / mL的裂解缓冲液均质化，并以2500rpm离心5-10分钟，使用上清液进行测试。

2.细胞样品：离心收集细胞（（10,000 g，0°C，15 min）。使用约1亿至1千万细胞/ mL裂解缓冲液，将处理后的溶液在室温下保持15分钟.2500℃离心 转速5分钟，并用上清液进行试验。

3.哺乳动物细胞样品：从平板孔中取出培养基，每1-5百万个细胞使用约100μL裂解缓冲液（或在96孔细胞培养板中使用50-100μL/孔），并将处理过的溶液保持在室温下 15分钟。 直接使用细胞裂解液或以1500 rpm离心5分钟，使用上清液进行测试。

4.组织样品：称取约20mg组织，用冷PBS洗涤。 在微量离心管中用400μl裂解缓冲液均化。 以2500rpm离心5-10分钟，使用上清液进行测定。

参考文献

β-Lapachone protects against doxorubicin-induced nephrotoxicity via NAD+/AMPK/NF-kB in mice
Authors: Davoud Sanajou, Saeed Nazari Soltan Ahmad, Vahid Hosseini, Ashkan Kalantary-Charvadeh, Yasser Marandi, Leila Roshangar, Saman Bahrambeigi, Mehran Mesgari-Abbasi
Journal: Naunyn-Schmiedeberg’s archives of pharmacology (2019): 1–8

Enhanced NADH Metabolism Involves Colistin-Induced Killing of Bacillus subtilis and Paenibacillus polymyxa
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Journal: Molecules (2019): 387

Engineering Corynebacterium crenatum for enhancing succinic acid production
Authors: Xiaoju Chen, Yaojie Zhou, Di Zhang
Journal: Journal of Food Biochemistry (2018): e12645

Influence of Boric Acid on Energy Metabolism and Stress Tolerance of Candida albicans
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Journal: Journal of Trace Elements in Medicine and Biology (2018)

Loss of sirtuin 1 and mitofusin 2 contributes to enhanced ischemia/reperfusion injury in aged livers
Authors: Sung Kook Chun, Sooyeon Lee, Joseph Flores-Toro, Rebecca Y U, Ming-Jim Yang, Kristina L Go, Thomas G Biel, Catherine E Miney, Schiley Pierre Louis, Brian K Law
Journal: Aging Cell (2018): e12761

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Journal: Nature communications (2018)

Stochastic expression of lactate dehydrogenase A induces Escherichia coli persister formation
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96孔板检测示例

概述

准备NAD / NADH反应混合物（50μL）

加入NADH标准品或测试样品（50μL）

在室温下孵育15分钟至2小时

监测460 nm处的吸光度

注意：在开始实验之前，在室温下解冻每个试剂盒组分中的一个。

操作步骤

1.准备NADH储备溶液：

将200μLPBS缓冲液加入到NADH标准品（组分C）的小瓶中以制备1mM（1nmol / L）NADH储备溶液。

注意：未使用的NADH储备溶液应分成单次使用的等分试样并储存在-20 ℃。

2.准备NAD / NADH反应混合物：

2.1将8 mL NADH探针缓冲液（组分B-II）加入到NAD / NADH回收酶混合物（组分A）的瓶中，并充分混合。

2.2将2 mL NADH探针（组分B-I）加入上述瓶中（来自步骤2.1）并充分混合。

注意：这种NAD / NADH反应混合物足以进行200次分析。未使用的NAD / NADH反应混合物应分成一次性等分试样并储存在-20℃。

3.准备NADH标准品的系列稀释液（0至10μM）：

3.1将10μL1mMNADH储备溶液（来自步骤1）加入990L PBS缓冲液（pH7.4）中，得到10μM（10pmol / L）NADH标准溶液。

注意：稀释的NADH标准溶液不稳定，应在4小时内使用。

3.2取200μL10M NADH标准溶液（来自步骤3.1）进行1：2连续稀释，得到5,2.5,1.25,0.625,0.313,0.156,0.078和0 M系列稀释的NADH标准品。

3.3如表1和2中所述，将含有NADH标准品和含NAD / NADH的测试样品的系列稀释液加入白色/透明底96孔微量培养板中。

注意：根据需要准备细胞或组织样本。

表1：白色/透明底96孔微孔板中NADH标准品和测试样品的布局

注意：NS = NADH标准，BL =空白对照，TS =测试样品

表2：每个孔的试剂组成

*注意：将连续稀释的NADH标准品（0.078μM至5μM）加入NS1至NS7的孔中，一式两份。 高浓度的NADH（例如，>100μM，最终浓度）将导致饱和信号并使校准曲线非线性。

4.在上清液反应中运行NADH测定：

4.1将50μLNAD/ NADH反应混合物（来自步骤2.2）加入NADH标准品，空白对照和测试样品的每个孔中（参见步骤3.3），使总NAD / NADH测定体积为100μL/孔

注意1：对于384孔板，每孔加入25μL样品和25μLNADH反应混合物。

注意2：根据需要准备细胞或组织样本。 为方便起见，裂解缓冲液（组分D）可用于裂解细胞。

4.2在室温下孵育反应15分钟至2小时，避光。

4.3用吸光度读板仪在460 nm处检测吸光度的增加。

数据分析

        空白孔中的吸光度（仅用PBS缓冲液）用作对照，并从具有NADH反应的那些孔的值中减去。 NADH标准曲线如图1所示。

图1. Amplite™比色NADP / NADPH比率分析试剂盒用于使用SpectraMax酶标仪（Molecular devices）测量白色/透明96孔微量培养板中的总NADP / NADPH量和NADP / NADPH比率。

A-总NADPH和NADP剂量反应：孵育1小时可检测到低至0.03μM的总NADPH。

B-NADP / NADPH比例：用或不用NADP提取溶液处理等量的NADP和NADPH混合物15分钟，然后在室温下用提取溶液中和。 在460nm读取信号。 NADP / NADPH摩尔比基于图1B中所示的吸光度计算。

附录：使用组分G（NAD / NADH裂解缓冲液）的测试样品制剂

1.植物细胞样品：

用裂解缓冲液以200mg / mL均化，并以2500rpm离心5-10分钟，使用上清液进行测试。

2.细菌样品：

离心收集细菌细胞（（10,000 g，0°C，15 min）。使用约1亿至1千万细胞/ mL裂解缓冲液，将处理后的溶液在室温下保持15分钟。以2500 rpm离心5分钟， 用上清液进行试验。

3.哺乳动物细胞样本：

从平板孔中取出培养基，每1-5百万个细胞使用约100μL裂解缓冲液（或在96孔细胞培养板中使用50-100μL/孔），并将处理过的溶液在室温下保持15分钟。 直接使用细胞裂解液或以1500 rpm离心5分钟，使用上清液进行测试。

4.组织样品：

称取约20mg组织，用冷PBS洗涤。 在微量离心管中用400μl裂解缓冲液均化。 以2500rpm离心5-10分钟，使用上清液进行测定。

参考文献

Functional definition of NrtR, a remnant regulator of NAD+ homeostasis in the zoonotic pathogen Streptococcus suis
Authors: Qingjing Wang, Bachar H Hassan, Ningjie Lou, Justin Merritt, Youjun Feng
Journal: The FASEB Journal (2019): fj–201802179RR

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Journal: Molecular Nutrition & Food Research (2017)

A Snapshot of the Plant Glycated Proteome STRUCTURAL, FUNCTIONAL, AND MECHANISTIC ASPECTS
Authors: Tatiana Bilova, Elena Lukasheva, Dominic Brauch, Uta Greifenhagen, Gagan Paudel, Elena Tarakhovskaya, Nadezhda Frolova, Juliane Mittasch, Gerd Ulrich Balcke, Alain Tissier
Journal: Journal of Biological Chemistry (2016): 7621–7636

AMPK activation protects cells from oxidative stress-induced senescence via autophagic flux restoration and intracellular NAD+ elevation
Authors: Xiaojuan Han, Haoran Tai, Xiaobo Wang, Zhe Wang, Jiao Zhou, Xiawei Wei, Yi Ding, Hui Gong, Chunfen Mo, Jie Zhang
Journal: Aging cell (2016): 416–427

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