DiBAC4（5）是一种敏感的膜电位探针，具有更长的激发和发射波长。它是用于测量细胞膜电位的慢响应探针。通常，慢响应探针在跨膜分布中表现出电位依赖性变化，并伴有荧光变化。它们的光学响应幅度远远大于快速响应探针（通常每mV荧光变化1％）。慢响应探针，包括阳离子碳花青素，罗丹明和阴离子恶臭酚，适用于检测由呼吸活动，离子通道通透性，药物结合和其他因素引起的非兴奋性细胞的平均膜电位变化。

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操作步骤

1.准备细胞：

1.1对于贴壁细胞：将细胞在生长培养基中以40,000至80,000个细胞/孔/ 100 µL（对于96孔板）过夜，以10,000至20,000个细胞/孔/ 25 µL（对于384孔板）过夜。

1.2对于非贴壁细胞：从培养基中离心细胞，然后将细胞沉淀以125,000至250,000个细胞/孔/ 100 µL 的浓度悬浮在等量的HHBS和MP染料上样溶液中（请参阅下面的步骤2.2），持续96-以及聚赖氨酸d板或30,000至60,000个细胞/孔/25μL的用于384孔聚赖氨酸d板。实验前将板以800 rpm的速度离心2分钟，并关闭制动器。

2.准备DiSBAC2（3）染料加载溶液：

2.1准备10至30 mM的DiSBAC2（3）的高品质无水DMSO 储备溶液。储备溶液应及时使用；任何剩余的溶液都需要等分并在< -20 ^o C 冷冻。

注意：避免重复的冻融循环，并避光。

2.2准备一个2X 的DiSBAC 2（3）染料加载 溶液： 在实验的当天，无论是溶解的DiSBAC 2（3） 固体在DMSO或解冻的等分试样的DiSBAC 2（3）的储备溶液至室温。用0.04％的制备的在Hanks（HHBS）20至40μM和20mM Hepes缓冲液，pH为7的2X工作溶液到0.08％的Pluronic ® F-127（目录＃20053）和2mM 锥虫红加 （目录＃2456），将它们混合均匀。该工作溶液在室温下至少稳定2小时。

3.运行膜电位测定：

3.1将100 µL /孔（96孔板）或25 µL /孔（384孔板）的DiSBAC2（3）染料加载溶液（来自步骤2.2）添加到细胞板中。

注1：如果您的筛选化合物干扰了g 培养基和血清因子，则在添加DiSBAC2（3）上染 溶液之前，用等体积的HHBS缓冲液替换生长培养基。或者，细胞可以在无血清条件下生长。

注2：上色后请勿清洗细胞。

3.2将染料加载板在细胞培养箱中孵育30至60分钟。

注意：在某些情况下，在室温下孵育30至60分钟可能会更好。

3.3使用HHBS或所需的缓冲液制备复合板。

3.4通过监测Ex / Em = 540/590 nm（目录号21414）的荧光强度进行膜电位测定。

注意：在实验之前进行信号测试非常重要。不同的仪器具有各自的强度范围。将信号测试强度调整为大仪器强度计数的10％到15％的水平。例如，FLIPR-384的大荧光强度计数为65,000，因此应调整仪器设置，使其信号测试强度约为7,000至10,000。

参考文献

A Membrane Potential-and Calpain-Dependent Reversal of Caspase-1 Inhibition Regulates Canonical NLRP3 Inflammasome
Authors: Yifei Zhang, Hua Rong, Fang-Xiong Zhang, Kun Wu, Libing Mu, Junchen Meng, Bailong Xiao, Gerald W Zamponi, Yan Shi
Journal: Cell reports (2018): 2356–2369

Effects of 1, 4-naphthoquinone Aged Carbon Black Particles on the Cell Membrane of Human Bronchial Epithelium
Authors: Yongming Zhang, Li Wang, Huimin Feng, Guiping Hu, Lele Wang, Jiaxing Liu, Xin Gao, Jing Shang, Tong Zhu, Shichuan Tang
Journal: Environmental Toxicology and Pharmacology (2017)

Humic analog AQDS can act as a selective inhibitor to enable anoxygenic photosynthetic bacteria to outcompete sulfate-reducing bacteria under microaerobic conditions
Authors: Xingzu Wang, Xiang Cheng, Yiwei Ren, Guihua Xu, Jing Tang
Journal: Journal of Chemical Technology and Biotechnology (2015)

Mitochondrial ROS-K+ channel signaling pathway regulated secretion of human pulmonary artery endothelial cells
Authors: Jin-Sheng Ouyang, Yu-Ping Li, Cheng-Ye Li, Chang Cai, Cheng-Shui Chen, Shao-Xian Chen, Yan-Fan Chen, Li Yang, Yu-Peng Xie
Journal: Free radical research (2012): 1437–1445

膜电位荧光探针DiBAC4(3)是美国AAT Bioquest生产的膜电位荧光探针，DiBAC4（3）是一种敏感的慢反应探针，用于测量细胞膜电位。通常，慢反应探针显示其跨膜分布的潜在依赖性变化，伴随荧光变化。它们的光学响应的​​幅度远大于快速响应探针的幅度（通常每mV的荧光变化为1％）。包括阳离子羰花青，罗丹明和阴离子氧杂菁的慢反应探针适用于检测由呼吸活动，离子通道渗透性，药物结合和其他因素引起的非兴奋细胞的平均膜电位的变化。金畔生物是AAT Bioquest的中国代理商，为您提供优质的膜电位荧光探针DiBAC4(3)。 

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操作步骤

1.准备细胞：

1.1对于贴壁细胞：在生长培养基中将细胞以40,000至80,000个细胞/孔/100μL在96孔板中培养过夜，或对于384孔板以10,000至20,000个细胞/孔/25μL。

1.2对于非贴壁细胞：从培养基中离心细胞，然后将细胞沉淀悬浮于等量的HHBS和MP染料加载溶液（参见下面的步骤2.2），125,000至250,000细胞/孔/100μL，96-以及聚赖氨酸d板或30,000至60,000个细胞/孔/25μL的用于384孔聚赖氨酸d板。在实验之前，在制动器关闭的情况下以800rpm 离心板2分钟。

注意：每个细胞系应在个人基础上进行评估，以确定佳的细胞密度为细胞内钙动员。

2.准备DiBAC4(3)染料加载溶液（1板）：

2.1在高质量无水DMSO中制备10至30 mM的DiBAC4(3)原液。应及时使用原液; 任何剩余的溶液需要被等分并冷冻在< -20℃。

注意：避免反复冻融循环，避免光照。

2.2准备 2X DiSBAC2(3) 染料加载溶液：在实验当天，将 DiSBAC2(3) 固体溶解在 DMSO 中，或将 DiSBAC2(3) 原液的等分试样解冻至室温。在 Hanks 和 20 mM Hepes 缓冲液 (HHBS) 或您选择的缓冲液（pH 7，含 0.04% 至 0.08% Pluronic® F-127（货号#20053）和 2 mM台盼红 0.1M水溶液）中制备 2X 工作溶液，浓度为 20 至 40 μM （Cat.# 2456）混合均匀。该工作溶液在室温下至少稳定 2 小时。

3.运行膜电位测定：

3.1将100μL/孔（96孔板）或25μL/孔（384孔板）DiBAC4(3)染料加载溶液（来自步骤2.2）加入细胞板中。

注1：如果您的筛选化合物干扰g rowth培养基和血清因子，在添加DiBAC4(3)染料加载 溶液之前，用等体积的HHBS缓冲液替换生长培养基。或者，细胞可以在无血清条件下生长。

注2：染料加载后不要洗涤细胞。

3.2将染料加载板在细胞培养箱中孵育30至60分钟。

注意：在室温下孵育30至60分钟可能会更好。

3.3使用HHBS或所需的缓冲液制备复合板。

3.4通过监测Ex / Em = 540 / 590nm处的荧光强度（Cat＃21414）进行膜电位测定。

注意：在实验之前运行信号测试很重要。不同的仪器有自己的强度范围。将信号测试强度调整到大仪器强度计数的10％至15％的水平。例如，FLIPR-384的大荧光强度计数为65,000，因此应调整仪器设置以使其信号测试强度在7,000到10,000左右。

参考文献

Multi-hierarchically Profiling the Biological Effects of Various Metal-Based Nanoparticles in Macrophages under Low Exposure Doses
Authors: Jie Zhang, Shunhao Wang, Ming Gao, Ruibin Li, Sijin Liu
Journal: ACS Sustainable Chemistry & Engineering (2018)

Effects of 1, 4-naphthoquinone Aged Carbon Black Particles on the Cell Membrane of Human Bronchial Epithelium
Authors: Yongming Zhang, Li Wang, Huimin Feng, Guiping Hu, Lele Wang, Jiaxing Liu, Xin Gao, Jing Shang, Tong Zhu, Shichuan Tang
Journal: Environmental Toxicology and Pharmacology (2017)

Humic analog AQDS can act as a selective inhibitor to enable anoxygenic photosynthetic bacteria to outcompete sulfate-reducing bacteria under microaerobic conditions
Authors: Xingzu Wang, Xiang Cheng, Yiwei Ren, Guihua Xu, Jing Tang
Journal: Journal of Chemical Technology and Biotechnology (2015)

Mitochondrial ROS-K+ channel signaling pathway regulated secretion of human pulmonary artery endothelial cells
Authors: Jin-Sheng Ouyang, Yu-Ping Li, Cheng-Ye Li, Chang Cai, Cheng-Shui Chen, Shao-Xian Chen, Yan-Fan Chen, Li Yang, Yu-Peng Xie
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Mechanisms of N α-lauroyl arginate ethyl ester against Penicillium digitatum and Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum
Authors: Xiao-Hui Xu, Zeng-Liang Jiang, Feng-Qin Feng, Rong-Rong Lu
Journal: Journal of Food Science and Technology: 1–8