Cyanine dyes 花青染料综述

花青染料是在两个带有离域电荷的氮原子之间含有聚次甲基桥的分子：

由于其结构，花青具有很高的消光系数，通常超过 100,000 Lmol -1 cm -1。不同的取代基可以控制发色团的特性，例如吸光度波长、光稳定性和荧光。例如，吸光度和荧光波长可以通过选择聚次甲基桥长度来控制：较长的花青具有较高的吸光度和发射波长，直至近红外区域。

许多花青染料已用于生命科学应用。一系列噻唑和恶唑染料已被用作 DNA 和蛋白质结合染料（如 TOTO、YOYO、Stains All 等）。但生命科学研究中受欢迎的花青染料是由卡内基梅隆大学的 Alan Wagoner 及其同事于 20 世纪 90 年代初推出的。这些染料是花青染料吲哚青绿 (ICG) 的改良版，自 20 世纪 70 年代起用于血管造影，它们都含有两个位于聚次甲基链侧的假吲哚环。人们发现这些染料与生物分子表现出低非特异性结合，并且由于其巨大的消光系数和良好的量子产率而具有明亮的荧光。可以从 Lumiprobe 购买，用于研究和商业用途，作为各种反应性衍生物，例如用于点击化学的NHS 酯、马来酰亚胺、叠氮化物以及其他衍生物。

花青染料有两种：非磺化花青和磺化花青。对于许多应用来说，它们是可以互换的，因为它们的光谱特性几乎相同。磺化和非磺化染料均可用于标记 DNA 和蛋白质等生物分子。染料之间的区别在于它们的溶解度：磺基染料是水溶性的，并且它们在水性环境中标记时不使用有机共溶剂。它们在水中不易聚集。在某些情况下，需要其中一种类型的花青（请参阅下面的“磺化花青与非磺化花青”部分）。

非磺化花青

可用的非磺化染料包括 Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7 和 Cy7.5。 Cy ®代表“花青”，第一个数字表示假吲哚基团之间的碳原子数。 Cy2 是一种恶唑衍生物，而不是吲哚宁，是该规则的一个例外。苯并稠合花青添加后缀 0.5。结构的变化可以改变分子的荧光特性，并用多个荧光团覆盖可见光和近红外光谱的最重要部分。

大多数非磺化花青衍生物（酰肼和胺的盐酸盐除外）的水溶性较低。当这些分子用于生物分子标记时，必须使用有机共溶剂（5-20％的DMF或DMSO）才能有效反应。花青染料应首先溶解在有机溶剂中，然后添加到生物分子（蛋白质、肽、氨基标记的 DNA）在适当的水性缓冲液中的溶液中。当缀合有效发生时，染料会在沉淀之前发生反应。

非磺化花青的荧光性质对溶剂和周围环境的依赖性很小。非磺化花青染料的吸光度和荧光光谱绘制如下。

磺化花青

磺化花青包含额外的磺基，其有利于染料分子在水相中的溶解。带电荷的磺酸基团减少染料分子和重度标记的缀合物的聚集。

目前可用的磺化花青包括磺基-Cy3、磺基-Cy5和磺基-Cy7。

磺化花青具有高度水溶性。使用这些试剂进行标记不需要有机共溶剂。

磺化花青与非磺化花青

磺化和非磺化花青表现出非常相似的荧光特性。然而，标签协议存在一些值得注意的差异。非磺化花青在使用前必须溶解在有机共溶剂（DMF 或 DMSO）中，并添加到目标分子在水性缓冲液中的溶液中。对于 Cy3、Cy5、Cy7，建议的共溶剂体积应为 10%，对于 0.5 对应物，建议的共溶剂体积应为 15%。磺基花青试剂可在纯水溶液条件下使用。纯化方面也存在差异：当使用水或水性缓冲液透析进行纯化时，必须使用磺基花青以实现有效去除未反应的染料物质。磺基和非磺基花青的反应可以通过凝胶过滤、色谱法（HPLC、FPLC、离子交换）或电泳进行纯化。

磺化和非磺化花青可互换用于标记许多类别的目标，包括：

• 可溶性蛋白质，可耐受有机共溶剂的添加

• 抗体（使用 5-10% DMSO/DMF）

• DNA和寡核苷酸

• 肽

• 许多小分子

使用相似的磺化和非磺化试剂（例如磺基-Cy5 和 Cy5）产生的缀合物的荧光特性非常相似，并且可以与各种荧光仪器一起使用。

磺化花青必须用于：

• 被 DMF 或 DMSO 变性的敏感蛋白

• 通过透析纯化时的蛋白质缀合

• 水溶液中的纳米颗粒

• 不溶性或疏水性蛋白质

非磺化花青必须用于：

• 有机介质（二氯甲烷、乙腈）中的反应

  Lumiprobe 提供以下花青产品。

• Fluorophore	Reactive form
  sulfo-Cy3	NHS ester maleimide azide alkyne carboxylic acid
  sulfo-Cy5	NHS ester maleimide azide alkyne carboxylic acid
  sulfo-Cy7	NHS ester azide amine carboxylic acid
  Cy3	NHS ester maleimide azide alkyne hydrazide amine carboxylic acid
  Cy3.5	NHS ester azide carboxylic acid
  Cy5	NHS ester maleimide azide alkyne hydrazide amine carboxylic acid
  Cy5.5	NHS ester maleimide azide alkyne hydrazide amine carboxylic acid
  Cy7	NHS ester maleimide azide alkyne hydrazide amine carboxylic acid
  Cy7.5	NHS ester maleimide azide alkyne hydrazide amine carboxylic acid