EMSA/凝胶转移测定
EMSA（电泳迁移率变动测定）用于研究蛋白质：DNA 复合物和相互作用。蛋白质：DNA 复合物在非变性凝胶上比未结合的线性 DNA 迁移得更慢，从而导致“移位”。
EMSA 也称为“凝胶位移”或“凝胶阻滞”测定，可用于分析蛋白质对核酸的序列特异性识别。
图 1. EMSA/凝胶位移测定图。当添加摩尔过量的未标记竞争DNA时，迁移率变化会大大降低。荧光标记的 IRDye 700 寡核苷酸探针用于检测。 IRDye 700 寡核苷酸在两条链上均进行末端标记。
近红外荧光的优点
近红外荧光 EMSA 为放射性 EMSA 技术提供了安全、灵敏的替代方案。
您可以轻松地将传统的放射性 EMSA 协议应用于无害的近红外荧光 EMSA 检测。使用 IRDye ®末端标记的寡核苷酸并使用 Odyssey ® CLx 红外成像仪或 Odyssey 经典红外成像仪进行成像。使用近红外荧光，您可以在不到 2 小时内进行测定并获得结果，而使用其他方法则需要几个小时或过夜。
使用近红外荧光技术的 EMSA 用于研究：
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转录调控
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DNA复制
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DNA修复
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RNA加工
图 2.EMSA/凝胶位移测定。 IRDye 700 EMSA 使用共有寡核苷酸针对 3 个不同的转录因子靶点进行测试。箭头表示移动性转变的位置。
您可以检测湿凝胶中的蛋白质：DNA 复合物，无需凝胶干燥或胶片曝光。如果需要，您可以在 Odyssey 扫描仪表面上对盒中的凝胶进行成像，以评估凝胶是否运行了足够长的时间，如果没有，请将其放回腔室中以进一步进行电泳。
即用型标记寡核苷酸 可用于各种常见的共有序列。其他 IRDye 末端标记寡核苷酸和定制寡核苷酸可通过Integrated DNA Technologies (IDT)、TriLink BioTechnologies或Metabion International AG 获得。
图 3. 使用 IRDye 700 AP-1 寡核苷酸双链体的 AP-1 EMSA。用血清处理的 HeLa 细胞的核提取物用于观察血清刺激后 AP-1 结合增加的情况。竞争反应含有 100 倍摩尔过量的未标记寡聚双链体。箭头表示荧光寡核苷酸的迁移率变化。星号表示由于过量未标记的竞争对手 DNA 引起的迁移率变化的减少。使用 Odyssey Classic 红外成像仪对湿凝胶进行成像。
红外荧光EMSA与其他方法的比较
比较 EMSA 检测方法，了解如何使用红外检测提高安全性并节省时间。
| IRDye ®红外荧光染料 | 放射性同位素 | 生物素/链霉亲和素（例如 Thermo Scientific LightShift） |
|---|---|---|
| 总时间： 1.5小时 | 总时间： 4.5 – 24 小时 | 总时间： 4.5 – 5 小时 |
| 轻松获取和处置 | 监管限制、处置麻烦和成本 | 联系制造商了解详情 |
| 荧光寡核苷酸具有更长的稳定性 | 标记寡核苷酸的半衰期短 | 化学发光信号不稳定 |
| 无危险 | 危险的 | 联系制造商了解详情 |
| 湿凝胶成像，无需移除凝胶板 | 需要凝胶干燥和胶片/荧光屏曝光 | 需要进行膜转移 |
| 快速、方便、直接检测 | 耗时、检测不方便 | 间接检测方法。需要封闭、链霉亲和素孵育和洗涤 |
| 如果需要，可以更换凝胶并延长运行时间 | 凝胶运行时间无法延长 | 凝胶运行时间无法延长 |
| 不到 2 小时即可得出结果 | 通常要到第二天才能获得结果 | 检测步骤使协议增加了几个小时 |
典型 EMSA 工作流程
准备反应并孵育20-30日 分钟
通过非变性电泳分离
使用 Odyssey Imager 进行图像凝胶并分析
*如果需要，请重复步骤 3 并再次成像。
