Amplite NAD+/NADH检测试剂盒(荧光法) 红色荧光-AAT Bioquest荧光染料

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Amplite NAD+/NADH检测试剂盒(荧光法) 红色荧光价格 4245
产品规格

400 Tests

产品货号

Amplite NAD+/NADH检测试剂盒(荧光法) 红色荧光

产品参数
Ex (nm) Em (nm)
分子量 溶剂
存储条件 在零下15度以下保存, 避免光照
产品概述

Amplite NAD+/NADH检测试剂盒(荧光法) 红色荧光是AAT Bioquest研发的检测NAD+/NADH的试剂盒。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD +)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP +)是细胞中发现的两种重要的辅因子。NADH是NAD +的还原形式,NAD +是NADH的氧化形式。NAD形成NADP,通过酯键将磷酸基团添加到腺苷核苷酸的2’位置。NADP用于合成代谢生物反应,例如脂肪酸和核酸合成,其需要NADPH作为还原剂。 在叶绿体中,NADP是在光合作用的初步反应中重要的氧化剂。通过光合作用产生的NADPH用作卡尔文光合作用循环中生物合成反应的还原能力。

传统的NAD / NADH和NADP / NADPH测定通过监测340nm处NADH或NADPH吸收的变化来进行。 Amplite™荧光总NAD和NADH检测试剂盒为敏感检测NAD和NADH提供了一种便捷的方法。系统中的酶特异性识别酶循环反应中的NAD / NADH,其显着提高了检测灵敏度。此外,该测定具有非常低的背景,因为其在红色可见范围内运行,这显着降低了生物样品引起的干扰。该测定已证明在Ex / Em = 540 / 590nm处具有高灵敏度和低干扰。金畔生物是AAT Bioquest的中国代理商,为您提供优质的Amplite NAD+/NADH检测试剂盒。

Amplite NAD+/NADH检测试剂盒(荧光法) 红色荧光

Amplite™荧光总NAD和NADH分析试剂盒提供灵敏的一步法分析,可在100μL分析体积(100nM;图1)中检测少至10皮摩尔的NAD(H)。 该测定可以以方便的96孔或384孔微量滴定板形式进行,并且容易适应自动化而无需分离步骤。 其信号可通过荧光酶标仪在Ex / Em = 530-570nm / 590-600nm(大Ex / Em = 540 / 590nm)或吸光度酶标仪在~576nm处容易地读取。

 

适用仪器


荧光酶标仪  
Ex: 540nm
Em: 590nm
Cutoff: 570nm
推荐孔板: 纯黑色孔板
实验方案

96孔板测定示例

 

概述

准备NAD / NADH反应混合物(50μL)

添加NADH标准品或测试样品(50μL)

在室温下孵育15分钟–2小时

监测Ex / Em = 540 / 590nm处的荧光强度

 

操作方法

1.准备NADH储备溶液:

将200μLPBS缓冲液加入到NADH标准品(组分C)的小瓶中,得到1mM(1nmol / L)NADH储备溶液。

注意:未使用的NADH储备溶液应分成单次使用的等分试样并储存在-20℃。

2.准备NAD / NADH反应混合物:

将10mL NAD / NADH传感器缓冲液(组分B)加入NAD / NADH再循环酶混合物(组分A)的瓶中,并充分混合。

注意:NAD / NADH反应混合物足以用于两个96孔板。 未使用的NAD / NADH反应混合物应分成一次性等分试样并储存在-20℃。

3.准备NADH标准品的系列稀释液(0至10μM):

3.1将10μL的NADH储备溶液(来自步骤1)加入到990L PBS缓冲液(pH 7.4)中,以产生10μM(10pmol / L)NADH标准溶液。

注意:稀释的NADH标准溶液不稳定,应在4小时内使用。

3.2取200μL10μMNADH标准溶液进行1:3连续稀释,得到NADH标准品的3,1,0.3,0.1,0.03,0.01和0μM连续稀释液。

3.3如表1和2中所述,将含有NADH标准品和含NAD / NADH的测试样品的系列稀释液加入到固体黑色96孔微量培养板中。

注意:根据需要准备细胞或组织样本。

 

表1实心黑色96孔微孔板中NADH标准品和测试样品的布局

BL

BL

TS

TS

NS1

NS1

….

….

NS2

NS2

 

 

NS3

NS3

 

 

NS4

NS4

 

 

NS5

NS5

 

 

NS6

NS6

 

 

NS7

NS7

 

 

注意:NS = NADH标准,BL =空白对照,TS =测试样品。

 

表2.每个孔的试剂组成

NADH Standard

Blank Control

Test Sample

Serial Dilutions*: 50 μL

PBS: 50 μL

50 μL 

注意:将连续稀释的NADH标准品(0.01μM至10μM)加入NS1至NS7的孔中,一式两份。 高浓度的NADH(例如,>100μM,终浓度)可能由于NADH传感器(对非荧光产物)的过度氧化而导致荧光信号降低。

 

4.在上清液反应中运行NAD / NADH测定:

4.1将50μL的NADH反应混合物(来自步骤2)加入NADH标准品,空白对照和测试样品(来自步骤3.3)的每个孔中,使得总NADH测定体积为100μL/孔。

注意:对于384孔板,每孔加入25μL样品和25μLNADH反应混合物。

4.2在室温下孵育反应15分钟至2小时,避光。

4.3用Ex / Em = 540 / 590nm的荧光板读数器监测荧光增加。

注1:也可将板的内容物转移到白色透明底板上,用吸光度酶标仪在576±5nm波长下读数。 与荧光读数相比,吸收检测具有较低的灵敏度。

注意2:对于NAD / NADH比率测量,建议使用试剂盒15263。

注意3:对于基于细胞的NAD / NADH测量,建议使用ReadiUse™哺乳动物细胞裂解缓冲液* 5X *(目录号20012)裂解细胞。

 

数据分析

 

        空白孔中的荧光(仅用PBS缓冲液)用作对照,并从具有NADH反应的那些孔的值中减去。 NADH标准曲线如图1所示。

注意:荧光背景随时间增加,因此减去每个数据点的空白孔的荧光强度值是很重要的。

Amplite NAD+/NADH检测试剂盒(荧光法) 红色荧光

图1.使用NOVOStar酶标仪(BMG Labtech),在固体黑色96孔板中用Amplite TM总NAD和NADH测定试剂盒测量NADH剂量反应。 在孵育1小时(n = 3)时可以检测到低至100nM(10pmol /孔)的NADH,而NADPH没有响应。

 

试剂应用文献

Epigenetic regulation of Runx2 transcription and osteoblast differentiation by nicotinamide phosphoribosyltransferase

Authors: Ling, Min and Huang, Peixin and Islam, Shamima and Heruth, Daniel P and Li, Xuanan and Zhang, Li Qin and Li, Ding-You and Hu, Zhaohui and Ye, Shui Qing
Journal: Cell & Bioscience (2017): 27

 

参考文献

Enhanced 1, 3-propanediol production in Klebsiella pneumoniae by a combined strategy of strengthening the TCA cycle and weakening the glucose effect
Authors: Xinyao Lu, Shunli Ren, Jingzheng Lu, Hong Zong, Jian Song, Bin Zhuge
Journal: Journal of applied microbiology (2018)

Celastrol attenuates angiotensin II mediated human umbilical vein endothelial cells damage through activation of Nrf2/ERK1/2/Nox2 signal pathway
Authors: Miao Li, Xin Liu, Yongpeng He, Qingyin Zheng, Min Wang, Yu Wu, Yuanpeng Zhang, Chaoyun Wang
Journal: European Journal of Pharmacology (2017): 124–133

Cytosolic Redox Status of Wine Yeast (Saccharomyces Cerevisiae) under Hyperosmotic Stress during Icewine Fermentation
Authors: Fei Yang, Caitlin Heit, Debra L Inglis
Journal: Fermentation (2017): 61

Epigenetic regulation of Runx2 transcription and osteoblast differentiation by nicotinamide phosphoribosyltransferase
Authors: Min Ling, Peixin Huang, Shamima Islam, Daniel P Heruth, Xuanan Li, Li Qin Zhang, Ding-You Li, Zhaohui Hu, Shui Qing Ye
Journal: Cell & Bioscience (2017): 27

MCU-dependent mitochondrial Ca2+ inhibits NAD+/SIRT3/SOD2 pathway to promote ROS production and metastasis of HCC cells
Authors: T Ren, H Zhang, J Wang, J Zhu, M Jin, Y Wu, X Guo, L Ji, Q Huang, H Yang
Journal: Oncogene (2017)

Metabolic and molecular insights into an essential role of nicotinamide phosphoribosyltransferase
Authors: Li Q Zhang, Leon Van Haandel, Min Xiong, Peixin Huang, Daniel P Heruth, Charlie Bi, Roger Gaedigk, Xun Jiang, Ding-You Li, Gerald Wyckoff
Journal: Cell Death & Disease (2017): e2705

Pyrroloquinoline Quinone, a Redox-active o-Quinone, Stimulates Mitochondrial Biogenesis by Activating SIRT1/PGC-1α Signaling Pathway
Authors: Kazuhiro Saihara, Ryosuke Kamikubo, Kazuto Ikemoto, Koji Uchida, Mitsugu Akagawa
Journal: Biochemistry (2017)

Resveratrol attenuates excessive ethanol exposure induced insulin resistance in rats via improving NAD+/NADH ratio
Authors: Gang Luo, Bingqing Huang, Xiang Qiu, Lin Xiao, Ning Wang, Qin Gao, Wei Yang, Liping Hao
Journal: Molecular Nutrition & Food Research (2017)

A Snapshot of the Plant Glycated Proteome STRUCTURAL, FUNCTIONAL, AND MECHANISTIC ASPECTS
Authors: Tatiana Bilova, Elena Lukasheva, Dominic Brauch, Uta Greifenhagen, Gagan Paudel, Elena Tarakhovskaya, Nadezhda Frolova, Juliane Mittasch, Gerd Ulrich Balcke, Alain Tissier
Journal: Journal of Biological Chemistry (2016): 7621–7636

AMPK activation protects cells from oxidative stress-induced senescence via autophagic flux restoration and intracellular NAD+ elevation
Authors: Xiaojuan Han, Haoran Tai, Xiaobo Wang, Zhe Wang, Jiao Zhou, Xiawei Wei, Yi Ding, Hui Gong, Chunfen Mo, Jie Zhang
Journal: Aging cell (2016): 416–427

 

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