Amplite NADP+/NADPH检测试剂盒(比色法)增强灵敏度-AAT Bioquest荧光染料

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Amplite NADP+/NADPH检测试剂盒(比色法)增强灵敏度价格 4245
产品规格

400 Tests

产品货号

Amplite NADP+/NADPH检测试剂盒(比色法)增强灵敏度

产品参数
Ex (nm) Em (nm)
分子量 溶剂 DMSO
存储条件 在零下15度以下保存, 避免光照
产品概述

Amplite 总NADP和NADPH检测试剂盒 (比色法)增强灵敏度是美国AAT Bioquest研发的检测总NADP和NADPH的试剂盒,烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD +)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP +)是细胞中发现的两种重要的辅因子。 NADH是NAD +的还原形式。 NAD形成NADP,通过酯键将磷酸基团添加到腺苷核苷酸的2’位置。传统的NAD / NADH和NADP / NADPH测定基于监测340nm处NADH或NADPH吸收的变化。 NAD / NADH和NADP / NADPH测定的短紫外波长使得传统方法具有低灵敏度和高干扰。 AAT Bioquest的Amplite™比色总NADP / NADPH检测试剂盒为检测总NADP和NADPH提供了一种便捷的方法。系统中的酶特异性识别酶循环反应中的NADP / NADPH。无需从样品混合物中纯化NADP / NADPH。酶循环反应显着提高了检测灵敏度。 NADPH探针是一种生色传感器,在NADP减少时具有460nm的大吸光度。 NADPH探针的吸收与溶液中NADPH的浓度成正比。 Amplite™比色总NADP和NADPH分析试剂盒提供灵敏的分析,可在100μL分析体积中检测低至0.03μM的总NADP / NADPH。与试剂盒#15260相比,该试剂盒具有更高的灵敏度。金畔生物是AAT Bioquest的中国代理商,为您提供优质的总NADP和NADPH检测试剂盒。 

 

适用仪器


吸光度酶标仪  
吸光度: 460 nm
推荐孔板: 透明孔板
实验方案

96孔板检测示例

概述

准备NADP / NADPH反应混合物(50μL)

加入NADPH标准品或测试样品(50μL)

在室温下孵育15分钟至2小时

监测460nm处的吸光度

注意:在开始实验之前,在室温下解冻每个试剂盒组分中的一个。

 

操作步骤

1.准备NADPH原液:

将200μLPBS缓冲液加入到NADPH标准品(组分C)的小瓶中以制备1mM(1nmol / L)NADPH储备溶液。

注意:未使用的NADPH原液应分成单次使用的等分试样并储存在-20℃。

 

2.制备NADP / NADPH反应混合物:

2.1将8mL NADPH探针缓冲液(组分B-II)加入到NADP / NADPH回收酶混合物(组分A)的瓶中,并充分混合。

2.2将2 mL NADPH探针(组分B-I)加入上述瓶中(来自步骤2.1)并充分混合。

注意:这种NADP / NADPH反应混合物足以进行200次分析。未使用的NADP / NADPH反应混合物应分成一次性等分试样并储存在-20℃。

 

3.准备NADPH标准品的连续稀释液(0至2μM):

3.1将2L 1mM NADPH储备溶液(来自步骤1)加入998L PBS缓冲液(pH7.4)中,产生2M(2 pmols / L)NADPH标准溶液。

注意:稀释的NADPH标准溶液不稳定,应在4小时内使用。

3.2取200μL2MNADPH标准溶液(来自步骤3.1)进行1:2连续稀释,得到1,0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0313和0M系列稀释的NADPH标准品。

3.3如表1和2中所述,将含有NADPH标准品和含NADP / NADPH的测试样品的系列稀释液加入白色/透明底96孔微量培养板中。

注意:根据需要准备细胞或组织样本。为方便起见,裂解缓冲液(组分D)可用于裂解细胞。 (详见附录)。 

 

表1:白色/透明底96孔微孔板中NADPH标准品和测试样品的布局

BL

BL

TS

TS

NS1

NS1

….

….

NS2

NS2

 

 

NS3

NS3

 

 

NS4

NS4

 

 

NS5

NS5

 

 

NS6

NS6

 

 

NS7

NS7

 

 

注意:NS = NADPH标准,BL =空白对照,TS =测试样品

 

表2:每个孔的试剂组成

NADPH Standard

Blank Control

Test Sample

Serial Dilutions*: 50 μL

PBS: 50 μL

50 μL 

*注意:将连续稀释的NADPH标准品(0.0313μM至2μM)加入NS1至NS7的孔中,一式两份。 高浓度的NADPH(例如,>30μM,终浓度)将导致饱和信号并使校准曲线非线性。

 

4.在上清液反应中运行NADPH测定:

4.1将50μL的NADP / NADPH反应混合物(来自步骤2.2)加入NADPH标准品,空白对照和测试样品的每个孔中(参见步骤3.3),使总NADP / NADPH测定体积为100μL/孔

注意1:对于384孔板,每孔加入25μL样品和25μLNADP/ NADPH反应混合物。

注意2:根据需要准备细胞或组织样本。 为方便起见,裂解缓冲液(组分D)可用于裂解细胞。 (详见附录)。

4.2在室温下孵育反应15分钟至2小时,避光。

4.3用吸光度读板仪在460 nm处检测吸光度的增加。

 

数据分析

        空白孔中的吸光度(仅PBS缓冲液)用作对照,并从具有NADPH反应的那些孔的值中减去。

Amplite NADP+/NADPH检测试剂盒(比色法)增强灵敏度

图1 使用SpectraMax酶标仪(Molecular devices),在96孔白色/透明底板中用Amplite ™比色总NADP和NADPH测定试剂盒*增强灵敏度*测量NADPH剂量反应。孵育1小时(n = 3)可以检测到低至0.03μM的NADPH,在460nm处测量吸光度。

 

附录:使用组分G(NAD / NADH裂解缓冲液)的测试样品制剂

 

1.植物细胞样品:用200mg / mL的裂解缓冲液均质化,并以2500rpm离心5-10分钟,使用上清液进行测试。

2.细胞样品:离心收集细胞((10,000 g,℃,15 min)。使用约1亿至1千万细胞/ mL裂解缓冲液,将处理后的溶液在室温下保持15分钟.2500℃离心 转速5分钟,并用上清液进行试验。

3.哺乳动物细胞样品:从平板孔中取出培养基,每1-5百万个细胞使用约100μL裂解缓冲液(或在96孔细胞培养板中使用50-100μL/孔),并将处理过的溶液保持在室温下 15分钟。 直接使用细胞裂解液或以1500 rpm离心5分钟,使用上清液进行测试。

4.组织样品:称取约20mg组织,用冷PBS洗涤。 在微量离心管中用400μl裂解缓冲液均化。 以2500rpm离心5-10分钟,使用上清液进行测定。

 

参考文献

Celastrol attenuates angiotensin II mediated human umbilical vein endothelial cells damage through activation of Nrf2/ERK1/2/Nox2 signal pathway
Authors: Miao Li, Xin Liu, Yongpeng He, Qingyin Zheng, Min Wang, Yu Wu, Yuanpeng Zhang, Chaoyun Wang
Journal: European Journal of Pharmacology (2017): 124–133

Cytosolic Redox Status of Wine Yeast (Saccharomyces Cerevisiae) under Hyperosmotic Stress during Icewine Fermentation
Authors: Fei Yang, Caitlin Heit, Debra L Inglis
Journal: Fermentation (2017): 61

Epigenetic regulation of Runx2 transcription and osteoblast differentiation by nicotinamide phosphoribosyltransferase
Authors: Min Ling, Peixin Huang, Shamima Islam, Daniel P Heruth, Xuanan Li, Li Qin Zhang, Ding-You Li, Zhaohui Hu, Shui Qing Ye
Journal: Cell & Bioscience (2017): 27

MCU-dependent mitochondrial Ca2+ inhibits NAD+/SIRT3/SOD2 pathway to promote ROS production and metastasis of HCC cells
Authors: T Ren, H Zhang, J Wang, J Zhu, M Jin, Y Wu, X Guo, L Ji, Q Huang, H Yang
Journal: Oncogene (2017)

Metabolic and molecular insights into an essential role of nicotinamide phosphoribosyltransferase
Authors: Li Q Zhang, Leon Van Haandel, Min Xiong, Peixin Huang, Daniel P Heruth, Charlie Bi, Roger Gaedigk, Xun Jiang, Ding-You Li, Gerald Wyckoff
Journal: Cell Death & Disease (2017): e2705

Pyrroloquinoline Quinone, a Redox-active o-Quinone, Stimulates Mitochondrial Biogenesis by Activating SIRT1/PGC-1α Signaling Pathway
Authors: Kazuhiro Saihara, Ryosuke Kamikubo, Kazuto Ikemoto, Koji Uchida, Mitsugu Akagawa
Journal: Biochemistry (2017)

Resveratrol attenuates excessive ethanol exposure induced insulin resistance in rats via improving NAD+/NADH ratio
Authors: Gang Luo, Bingqing Huang, Xiang Qiu, Lin Xiao, Ning Wang, Qin Gao, Wei Yang, Liping Hao
Journal: Molecular Nutrition & Food Research (2017)

A Snapshot of the Plant Glycated Proteome STRUCTURAL, FUNCTIONAL, AND MECHANISTIC ASPECTS
Authors: Tatiana Bilova, Elena Lukasheva, Dominic Brauch, Uta Greifenhagen, Gagan Paudel, Elena Tarakhovskaya, Nadezhda Frolova, Juliane Mittasch, Gerd Ulrich Balcke, Alain Tissier
Journal: Journal of Biological Chemistry (2016): 7621–7636

AMPK activation protects cells from oxidative stress-induced senescence via autophagic flux restoration and intracellular NAD+ elevation
Authors: Xiaojuan Han, Haoran Tai, Xiaobo Wang, Zhe Wang, Jiao Zhou, Xiawei Wei, Yi Ding, Hui Gong, Chunfen Mo, Jie Zhang
Journal: Aging cell (2016): 416–427

Cell-Line Selectivity Improves the Predictive Power of Pharmacogenomic Analyses and Helps Identify NADPH as Biomarker for Ferroptosis Sensitivity
Authors: Kenichi Shimada, Miki Hayano, Nen C Pagano, Brent R Stockwell
Journal: Cell chemical biology (2016): 225–235

 

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