CLiM™技术——CLiM™亲和标签系统简介
CLiM™亲和标签系统
CLiM ™ 亲和标签系统基于两种小蛋白质之间形成的超高亲和力复合物。 CL7 (16 kDa) 是与靶蛋白融合的标签，lm7 (10 KDa) 是与琼脂糖树脂偶联的配体。
CL7 的 WT 版本是 CE7 DNase，一种有毒细菌蛋白。工程突变消除了其 DNA 结合和 DNAse 活性，同时保留了与 lm7 的超高亲和力。
成分
CL7标签
CL7 标签可以表达在目标蛋白的 N 或 C 末端。我们的质粒提供溶解度标签、亲和标签和切割位点的组合以及多种克隆选项。
在对照实验中，CL7 对溶解度或表达没有表现出负面影响。事实上，当在没有标签的大肠杆菌中表达时，CL7 提高了原本不溶的蛋白质的表达水平和溶解度。当用 CL7 标签表达时，一些临床和治疗相关的蛋白质从不溶性部分转移到可溶性部分。纯化可溶表达的蛋白质不需要变性剂或包涵体重折叠。这些蛋白质在基于细胞的测定中表现出与其他商业/临床样品相同的生物活性。
Im7树脂
lm7 树脂由固定在琼脂糖树脂上的 CL7 结合伴侣 lm7 组成。 lm7 和 CL7 之间的高度特异性亲和力导致树脂脱靶最小化。 35-40 mg/mL 的高树脂结合能力可以捕获大量 CL7 标记的蛋白质。 lm7 结构域具有高度弹性：使用 Gdn-HCI，树脂可以再生并重复使用多达 100 次。
洗脱蛋白酶
蛋白酶对于从 lm7 树脂柱上洗脱目标蛋白至关重要。 TriAltus 生产自己的高活性、超高亲和力纯度的 SUMO 和 PSC 蛋白酶。这两种 TriAltus 蛋白酶的裂解速度比竞争对手的产品更快，而且成本更低。
例如，如果 60-80 mg 蛋白质与 5 mL 柱结合，则 1 mg 蛋白酶溶于 20 mL 洗脱缓冲液中，流速为 0.2 mL/min，只需 1.5-2 小时即可洗脱蛋白质。少量的蛋白酶太稀了，可能不需要去除。如果需要，可以使用用于 SUMO 的镍柱和用于 PSC 的谷胱甘肽来执行抛光步骤。
SUMO
SUMO 蛋白酶用于洗脱 N 末端标记蛋白。这种高度特异性的酶可识别 SUMO 结构域的三级结构并切割其 C 端，切割后不留下任何氨基酸残基。其特异性使其切割速度比 PSC 更快。 4°C 下， 1 μg SUMO 在 30 分钟内将 2 mg 底物裂解 96%，在 40 分钟内裂解 99%。
PSC
PSC 蛋白酶用于切割 N 或 C 末端标记的蛋白质。它也非常高效：在 4 °C 下，20 μg PSC 将在 40 分钟内以 91% 的速度裂解 2 mg 底物，在 60 分钟内以 99% 的速度裂解 。
一步层析纯化方案
CL7 和 Im7 的盐独立性和高度特异性的结合亲和力可实现简单且简化的实验方案。 CL7 不是使用 His-trap 作为第一步，然后使用特殊标签来精炼蛋白质，而是通过一个色谱步骤即可实现超高纯度。
优点
蛋白质纯化系统根据其在两个参数下的性能进行评估：产量和纯度。 CLiM™ 亲和标签系统在两个账户上的表现都优于 His 标签和特殊标签。
屈服
TriAltus 的高结合能力树脂的高效偶联方法远远优于其他专用标签的树脂。 lm7 6B 树脂的结合能力在 35-40 mg/mL 范围内，4B 树脂的结合能力 >60 mg/mL。
纯度
蛋白质纯化系统可达到的纯度取决于其对未标记细胞成分的敏感性。杂质类型包括基于标记靶蛋白/细胞成分相互作用的杂质以及由于未标记细胞成分与柱结合配体的非特异性结合而产生的杂质。
与靶蛋白的相互作用
在高盐浓度缓冲液存在的情况下，CL7 与 Im7 的结合不受干扰。高盐缓冲液可在纯化过程的早期去除杂质，以获得洁净的最终产品。特殊标签对约 0.2-0.3 M 的盐浓度敏感，导致第一个色谱步骤后纯度较低。
非特异性结合
CL7 和 Im7 彼此具有高度的特异性。这可以防止标签或配体与细胞成分（例如 DNA 和其他蛋白质）之间的非特异性相互作用。 IMAC 系统容易与树脂中的金属离子发生非特异性结合。
高耐盐性和高特异性结合的结合导致了如此高的纯度，以至于 CL7/lm7 系统仅需要一个色谱步骤。
纯化的具有挑战性的蛋白质
多亚基RNA聚合酶-ttRNAP
ttRNAP（嗜热菌RNA 聚合酶）是一种约 400 kDa 的大蛋白，具有 5 个亚基 ( α 2 ββ'ω) 和 4 个结合位点。传统上，纯化需要五个连续的层析步骤才能获得足够高的纯度以实现高活性。蛋白质纯度与其活性直接相关。将细胞裂解物装入 1.5 M 盐缓冲液中是一步纯度的关键。 CL7 标签仅附着在最大的 β' 亚基上， 不会干扰亚基组装。
DNA/RNA 结合蛋白 – Cas9
Cas9是CRISPR技术的重要组成部分。 Cas9 活性与其纯度直接相关，但通常需要 4-5 个色谱步骤才能达到所需的纯度。 Cas9 带有 CL7 标签并加载在 1.5 M 盐缓冲液中，一步纯化即可达到 99% 的纯度。该酶在细胞检测和 体外 检测中均显示出高活性。
膜蛋白-YidC
YidC 是一种~32 kDa 细菌膜整合酶。膜蛋白很难纯化，因为与细胞成分的疏水接触会造成污染。由于组氨酸标签非特异性地结合到其柱上，因此在一步纯化后会出现大量杂质。 CL7 对 Im7 的特异性最大限度地减少了这些影响，使纯度高达 99%。
折叠不良的治疗蛋白 – GCSF、hGH 和 IFN- α
FDA 批准的三种生物制剂——GCSF、hGH 和 IFN-α——各自具有两个内部半胱氨酸桥，在没有标签的大肠杆菌中表达时通常不溶。纯化不溶性蛋白质通常涉及棘手的重折叠步骤，然后是多个色谱步骤。 CL7 增强蛋白质的表达、稳定性和折叠，使它们不再以包涵体形式表达。这些蛋白质表现出与基于细胞的阵列中的其他商业/临床样品相当的生物活性。
