Duolink® PLA故障排除指南

建议及技巧：

用于蛋白检测的Duolink® PLA技术可提供一种具有一系列明确定义步骤的简易而直接的实验方法。该章节将会对可确保Duolink® PLA实验顺利进行的一些重要注意事项进行描述。

一、前期考虑：

1.采用在待测样品内可具有最佳一抗性能的条件。这些条件包括样品处理参数（固定、通透化、抗原修复等）、一抗效价以及孵育时间。

2.为了可对结果进行正确的评估，在实验中总是需要设置技术及可用的生物学对照。

3.Duolink® PLA Control Kit是一款可对技术进行检测并获取成功结果的便捷工具。它包含有利 Duolink® PLA试剂进行蛋 白间相互作用观察的带有预铺板细胞的显微玻片以及一对抗体。PLA信号是具有保障的。采用该款对照试剂盒可提升Duolink® PLA技术的可靠性或为您的实验增添更多的对照。

二、常见实验参数：

1.永远不要让您的样品变干。在加湿箱中进行孵育步骤。

2.确保去除样品中多余的洗涤溶液。残留的洗涤溶液会造成抗体的进一步稀释并降低连接或扩增的效率。

3.可采用一支疏水笔将样品圈出来。当使用孔板玻片时，这将有助于防止孔间的溶液交叉污染。当使用组织切片时，这可以将所需的试剂体积降低到低值。

4.在合适的温度及孵育时间条件下进行所有的步骤以获取最佳的结果，特别是酶相关的步骤（连接及扩增）。

5.在进行低丰度蛋白检测时，可能需要将扩增时间进行延长。如果在这些条件下出现背景提升，可使用Duolink®Brightfield Amplification Buffer（不含有检测寡核苷酸）独立进行扩增和检测步骤，并随后采用Duolink®Fluorescent Amplification Buffer（含有检测寡核苷酸）进行一步30分钟的孵育。

6.在大量的洗涤溶液中进行洗涤并确保样品被覆盖。按要求分别使用洗涤溶液A或B。在室温进行洗涤。

7.在使用过程中将酶放置在冰冻模块中。确保其他的试剂解冻（如连接溶液和扩增溶液）并在使用前进行涡旋混匀。

三、样品储存及分析：

1.所有的® PLA探针必须储存在4 °C；包括使用Duolink® Probemaker生成的。不要冻存，否则结果将会被显著减弱。

2.对于荧光相关的应用，在使用带有DAPI的Duolink® Mounting Media进行封片后将玻片避光储存在4 °C最长可达4天。密封储存在-20 °C最长可达6个月。

3.不可过度曝光。荧光信号会发生聚结使得获取准确的定量分析结果更加困难。需要注意的时，信号聚结并不会影响流式细胞分析。

4.实验及对照样品应采用相同的捕获参数进行拍照成像。

四、故障排除：

尽管注意到了所有的注意事项，也使用一些很好的建议和技巧，结果有时也不是会符合预期。阳性对照无信号以及高背景是免疫检测实验中最为常见的两种问题，并在使用Duolink® PLA技术时也有可能会发生。下表列举了这些常见问题的可能诱因以及建议的解决方案。