关于 Duolink® PLA实验的实验设计与准备

要成功地执行 Duolink® PLA 实验，实验方案中有一些必要的考虑因素需要正确地准备、设置和执行。Duolink® PLA 产品可用于荧光和明场。荧光 Duolink® PLA 试剂可用于显微镜和流式细胞术应用。

一、实验设计

要设计一个成功的Duolink® PLA实验，必须考虑很多因素。这些因素包括但不限于：

1.确定蛋白质靶标和实验类型

2.选择样品（细胞或组织）

3.设计您的读出方案

4.设计实验对照（技术和生物）

靶标识别：

首先要确定的是目标蛋白靶标。是单一蛋白质表达，蛋白质与蛋白质的相互作用 (PPI)，还是蛋白质翻译后修饰 (PTM)？下面简要介绍了 Duolink® PLA 如何用于检测各种类型的蛋白靶点。

单一蛋白表达的检测：

检测单个蛋白靶标有两种方法，即使用针对靶标的一种一抗进行单一识别或两种一抗进行双重识别。

 

单一识别：

具有最高的灵敏度，建议在检测低表达水平的单一蛋白质靶标时使用。也可用于双重识别实验前对单个一抗浓度的测定。但是，只有当性能良好的特异性一抗可用时，才推荐使用此方法。由于测定的敏感性，使用非特异性一抗将导致高背景。

双重识别：

通过使用两种一抗提供了更高的特异性。每种一抗必须针对同一靶分子上不同的、非竞争性的表位。而且，这两种一抗必须在不同物种（小鼠、兔或山羊）中培养，并且必须在相同的实验条件下与靶标结合。这些条件在下面的实验准备部分中进行了描述。

蛋白质与蛋白质的相互作用检测：

Duolink® PLA是检测蛋白质相互作用的方法。该方法使用两种一抗来完成，每种抗体针对一种目标靶标，且在不同物种（小鼠、兔或山羊）中培养。两种一抗必须在相同的实验条件下与靶标结合。

 

蛋白质与核酸的相互作用检测：

蛋白质-DNA 和蛋白质-RNA 相互作用也可以通过使用修饰的原位杂交技术结合Duolink® PLA来进行检测。

二、实验准备

为确保成功执行 Duolink® PLA 实验，需要进行大量准备工作。这些准备工作与传统的 IF、IHC 或流式细胞术所需的工作类似。本节描述了一抗鉴定、样品制备和抗体优化的注意事项。

 

一抗的选择：

Duolink® PLA试剂是使用二抗进行靶标特异性一抗检测的通用试剂。设置 Duolink® PLA 实验时，一抗的选择至关重要。

 

要求：

Duolink® PLA探针是驴抗小鼠、抗兔或抗山羊二抗；因此，对一抗有特定要求。这包括：

1.IgG 类

2.可以是单克隆或多克隆

3.优选亲和纯化以使交叉反应性最小化

4.建议使用 IF 或 IHC 验证

5.宿主必须是小鼠、兔子或山羊（特例情况要求使用Duolink® Probemaker）

 

直接偶联一抗的使用：

有些情况下需要使用直接偶联的一抗。Duolink® Probemaker能够将 PLA oligo (PLUS 或 MINUS) 偶联到任何抗体上。使用 Duolink® Probemaker 的注意事项如下：

1.当一抗的宿主不是小鼠、兔或山羊时

2.当使用来自同一物种的两种一抗时

3.当使用在与组织样品相同的宿主中产生的一抗时（例如，“小鼠一抗检测小鼠样品“）

 

一抗优化：

为了成功执行 Duolink® PLA 实验，确定待测样品中最佳一抗性能的条件非常重要。一抗优化的条件应包括：

1.样品处理（固定、透化和抗原修复）

2.一抗浓度

3.阻断溶液和抗体稀释剂

 

下面介绍样品处理、阻断和抗体稀释剂的具体注意事项。强烈建议首先通过 IF 或 IHC 染色鉴定一抗的条件。当使用两种一抗时，每种一抗的优化应分开进行，但样品处理需要兼容两种一抗的最佳性能。

一旦 通过IF 或 IHC 确定了条件，这些条件就可以应用于 Duolink® PLA。但是，Duolink® PLA 实验可能需要进一步滴定一抗浓度，因为与 IF 和 IHC 相比，Duolink® PLA 具有更高的灵敏度和更放大的信号。使用上述Duolink® PLA单一识别方法可在优化一抗浓度时提供最高的灵敏度。这些条件可用于使用两种一抗的 Duolink® PLA 实验。