A：“数字PCR可以两色荧光做三重或者四重检测！”

B：“这怎么可能？”

A：“这很简单，让我仔细道来……”

如何实现多重定量检测？

多重检测即在一个反应中同时检测出多种不同的基因，可以带来更全面和准确的检测结果。分子检测发展至今，一方面对灵敏度和准确性带来更高的要求，另一方面也对多重检测也带来更多的需要。多重分子检测目前使用广泛的方法是荧光定量PCR，使用多色荧光的方式进行多重检测，但受制于硬件及试剂限制，荧光定量PCR多重检测一般限制在5色以内。数字PCR的出现，在满足更好灵敏度和直接定量的高要求同时，也能够突破荧光通道的限制，带来更多重的检测。

案例分享：新冠病毒委外标准品检测实验

实验设计

在新型冠状病毒检测中，根据国家CDC发布的指导原则，需要同时检测新冠病毒ORF1ab基因和N基因。与此同时，还增加了人RNase P基因的检测用于对样品进行质控，因此最终需要三重检测。传统思路下，需要使用三色荧光探针分别对应三个荧光通道进行检测，但在数字PCR检测中，仅使用两个荧光通道即可。

在数字PCR双荧光三重检测中，在配置试剂时，ORF1ab使用高浓度的FAM特异探针，ORF1ab基因使用高浓度的CY5特异探针，而RNase P基因同时使用低浓度同序列但不同修饰的FAM探针和CY5探针。在形成分区后，每个分区都含有相同类型和浓度的探针，而每个分区中，理想情况下只有ORF1ab/N/Rnase P三种基因的单个基因。PCR反应后，含有N基因的分区，会发出高强度的FAM信号；含有ORF1ab基因的分区，会发出高强度的CY5信号；含有RNase P基因的分区会同时发出低强度的FAM和CY5信号。因此，可以通过每个分区中的荧光信号类型及其强度，判断为哪种基因的阳性液滴，最后通过各基因阳性液滴的数量，结合泊松分布公式，即可测算各基因的浓度。

随着基因浓度的增加，每个分区也会有多种基因的情况，此分区的荧光信号就是各种基因对应荧光的累加。例如，OFR1ab和N基因同时在一个液滴中，则此液滴的荧光信号即为高强度的FAM和高强度的CY5信号；OFR1ab基因和CY5基因在同一个液滴中，此液滴的荧光信号即为超高强度的CY5信号和低强度的FAM信号，以此类推（见下图）。因此可以轻松判断出每一个液滴里面所含有的基因类型。

实验步骤

1、RT反应体系预混：把Mix试剂、RT逆转录所需的酶、引物探针预混。

2、假病毒稀释样品：4个浓度梯度的假病毒样品。

3、液滴生成：每孔加入20微升反应体系（预混液13微升+待测样品液7微升）和70微升油，生成多组平行样品液滴。

4、PCR扩增循环：进行RT-ddPCR一步法扩增反应。

5、使用达普星云数字PCR进行液滴扫描成像，并分析结果。

结果展示

该实验是某检测机构首次应用达普星云数字PCR来对新冠病毒标准品的定量检测，模拟在低浓度范围内对新冠病毒的检测能力。结果显示，在低拷贝数的四个浓度梯度下，检测结果符合预期，R2线性结果好。值得一提的是，数字PCR具有超高的检测灵敏度和优秀的重复性，反应检测限可低至0.2cp/μl，用户表示满意。

讨论：如何实现更多重检测？

当需要检测更多重的基因时，只需要对每种基因对应的探针类型和浓度进行配置即可。如双色荧光四重检测：A基因为FAM高浓度探针，B基因为FAM低浓度和CY5中浓度探针，C基因为FAM中浓度和CY5低浓度探针，D基因为CY5高浓度探针（见下图）。而随着荧光通道的增加，搭配的可能性会有无限提升。

当然，随着检测基因的增加，散点团也会成倍的增加，在双通道四重分析中（见上图），2D图已经有16个散点团。只有散点团相互分离，才能对每一个液滴进行准确分析，这对数字PCR系统带来的更高的要求：更稳定的液滴，更高效的试剂，更优秀的光路。

达普生物科技，拥有多项液滴微流控专利技术，团队布局芯片、试剂、光路、软件等数字PCR全产业链，完全掌握数字PCR的每一个细节。现已上市的星云数字PCR系统Lite版，可以完美实现双色荧通道四重检测分析，并实现精准定量，达到国际领先水平。达普生物将会在近期推出新一代数字PCR系统Pro版，届时三个荧光通道，带来更多无限可能。

达普数字PCR系统lite版已上市

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